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背景和目的当前,恶性肿瘤已经成为人类健康的一大危害,严重地影响了人们的生活质量、生存健康。因此研究开发高效抗肿瘤药物、探讨新的肿瘤治疗途径,帮助肿瘤患者早日摆脱病痛折磨,提高生存质量,延长生命成为研究工作者的当务之急。近年来,人们发现某些病毒具有抗肿瘤能力,其中新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）以其抗肿瘤作用强、对人安全性高等特点吸引着越来越多的关注。NDV为副粘病毒科Avulavirus属的一员,能感染多种人类肿瘤细胞且不依赖于肿瘤细胞增殖而独立复制,特异性杀伤肿瘤细胞,而对人体多数正常细胞无很大影响。研究显示,不同的NDV株系其抗肿瘤谱及抗肿瘤效果也不尽相同,国外针对特异性溶瘤株73-T等进行了较多研究,并取得了一定的临床实验效果。国内研究多集中在疫苗株La Sota上,对于NDV特异性抗肿瘤毒株的选育研究则较为滞后。本研究以人小细胞肺癌细胞NCI-H446、人胚肺成纤维细胞HFL-1和NCI-H446裸鼠移植瘤模型为研究对象,对14株NDV的体外抗肺癌细胞效应及安全性进行了评价,研究了弱毒株对NCI-H446裸鼠移植瘤生长的抑制作用。材料和方法选取12株分离自香港的NDV,1株分离自江西鄱阳的NDV及1株NDV疫苗株,接种鸡胚,扩增病毒,48小时后收取鸡胚尿囊液,测定血凝效价≥1∶1024后,调整至1×108PFU/ml,保存于-80℃冰箱。常规方法培养非洲绿猴肾细胞Vero-E6、人小细胞肺癌细胞NCI-H446和人胚肺成纤维细胞HFL-1。用MTT法检测14株病毒对肺癌细胞及正常成纤维细胞的杀伤作用,初步筛选出对肺癌细胞杀伤作用强而对正常成纤维细胞影响小的NDV作为候选毒株。将候选毒株在肺癌细胞内进行选择性扩增,并用Vero-E6细胞进行蚀斑纯化。得到纯化病毒株后再次扩增,检测其HA效价、TCID50及对肺癌细胞和正常细胞的杀伤作用,并通过多重RT-PCR法鉴别病毒株毒性强弱。将处于对数生长期的NCI-H446细胞用0.25%的胰酶和0.02%的EDTA消化,收集并调整为5×107个/ml细胞悬液备用。每只裸鼠取1个注射点,用上述细胞液0.2ml注射于皮下,接种后每天观察有无肿瘤形成及注射点有无破溃红肿,当肿瘤长径和短径均达5mm后进行分组。通过醛化红细胞法收集尿囊液中病毒颗粒,PBS稀释至1×107PFU/ml作为NDV注射液,实验组每只裸鼠瘤内注射0.1ml。按规定时间测量肿瘤体积大小及裸鼠体重,绘制肿瘤生长曲线。NDV注射6周后处死裸鼠,秤量瘤块和脾脏,计算抑瘤率和脾脏指数,进行毒性评价,肿瘤组织用10%的福尔马林溶液固定,行HE染色,评价移植瘤细胞在光学显微镜下的病理变化。通过S-P免疫组化检测移植瘤中Bax和Bcl-2蛋白的表达情况。结果1.实验中14株NDV对人小细胞肺癌细胞株NCI-H446有较强的杀伤作用,同等条件下对人胚肺成纤维细胞株HFL-1影响较小（P＜0.01）。2.本实验中除NDV D713株外,13株NDV对肿瘤细胞的杀伤效应与病毒作用时间呈正相关。3.NDV D713株作用48小时后对肿瘤细胞的杀伤效应随病毒浓度的降低而增强。4.候选NDV毒株D417株和D922株对肺癌细胞有较强杀伤性,感染肺癌细胞48小时后可导致90%左右的细胞死亡,但是对正常肺部细胞影响较小,48小时后杀伤率仅20%左右。5.NDV D417株和NDV D922株能够在肺癌细胞中复制增殖,其HA效价的增长速度为正常肺部细胞中生长的64～128倍。6.NDV D417株与NDV D922株体外抗肺癌作用相比,在高浓度病毒作用情况下（106～107 PFU/ml）差别无统计学意义,低浓度病毒作用情况下（104～105PFU/ml）NDV D417株抗肺癌作用较强。7.经过肺癌细胞中选择性扩增传代后候选NDV毒株对肺癌细胞的杀伤效应有部分提高,对肺部正常细胞的杀伤效应无显著性变化。8、裸鼠皮下接种肺癌细胞10天后明显成瘤,成功建立了人小细胞肺癌裸鼠移植瘤模型,成瘤率100%。9、NDV 7793株和阳性对照药顺铂注射液均能抑制移植瘤生长,抑制率分别为34.1%和50.7%。10、NDV 7793株治疗对裸鼠无明显毒副作用,而顺铂给药治疗阳性对照组对裸鼠存在明显毒副作用。11、病理学检查结果显示与阴性对照组相比,NDV组肿瘤细胞形态模糊,细胞坏死/凋亡范围较大。12、免疫组化检测显示NDV组肿瘤细胞Bax蛋白的表达程度高于阴性对照组,差别具有统计学意义（P＜0.01）。NDV组Bcl-2蛋白的表达与阴性对照组相比无显著性差异。结论1.实验所选14株NDV具有选择性在人小细胞肺癌细胞中复制增殖和杀伤癌细胞的作用,具备抗肿瘤生物治疗应用潜能;其中筛选出的D417株和D922株NDV具有较强的抗肿瘤效应。2.NDV病毒株DK/HK/417/1978和DK/HK/922/1980均属于强毒力病毒株。3.NDV病毒株WDK/JX/7793/2004对人小细胞肺癌裸鼠皮下移植瘤生长有明显的抑制作用。4.NDV病毒株WDK/JX/7793/2004抗小细胞肺癌的作用机制可能与上调Bax蛋白的表达有关。