背景与目的骨髓间质干细胞(marrow mesenchymal stem cells, MSCs)是一类可以从成熟骨髓、脐带血及脂肪组织等多种组织分离出来,具有多向分化潜能干细胞。MSCs具有很强的自我增殖、多向分化能力,在特定的条件下可以向不同的细胞进行分化,既可以向中胚层组织分化如骨细胞、心肌细胞等,又可以向外胚层组织分化如神经细胞等。MSCs具有来源方便、增殖能力强大、多向分化潜能等优点,因此在临床主要应用于血液系统疾病,心血管疾病,以及神经系统疾病的诊断与治疗。尤其是在神经系统疾病方面,MSCs的发现为神经系统变性病、中枢神经损伤等患者提供了新的治疗方法,具有长远的发展前景。诱导MSCs向神经细胞分化是一种横向的分化方式,存在着分化效率低、分化调节机制不明确等缺点,因此需要进一步研究。TOR最初是在啤酒酵母的突变株TOR1和TOR2中发现的,TOR1和TOR2基因编码两个大的(280kDa)高度同源的(70%)TOR1和TOR2。1996年,(?)Abraham等在哺乳动物中也发现了结构和功能保守的TOR,称为mTOR。mTOR的C末端有一个激酶结构域,约234个氨基酸,因此被认为是磷脂酰肌醇3-激酶相关激酶(PIKK)蛋白质家族成员。在哺乳动物中只有一个mTOR基因,在人、小鼠和大鼠中都编码2549个氨基酸,目前可以确定的是mTORC1至少包含mTOR、 raptor和mLST8三种蛋白,而mTORC2至少包含mTOR、rictor和mLST8三种蛋白。mTOR的上下游信号转导途径较为复杂,胰岛素、生长因子(胰岛素样生长因子,血小板源性生长因子和表皮生长因子等)合于跨膜胰岛素受体或酪氨酸激酶受体(IR,RTK)后,激活Ⅰ型磷脂酰肌醇三磷酸激酶(Class I PI3K),使PIP被磷酸化为PIP3,PIP3结合于Akt/PKB和它的活化分子PDK1。mTOR效应器4EBP1和S6Ks, mTOR活性抑制时,促进自噬体形成。PI3K/Akt/mTORCl信号通路是调控细胞生长与增殖的关键通路,该通路将营养分子、能量状态以及生长因子传来的信号整合在一起,调控大量的生命过程,包括自噬、核糖体的生物合成和代谢等。因此本实验以骨髓间质干细胞为研究对象,通过不同浓度mTOR特异性抑制剂雷帕霉素的处理,观察骨髓间质干细胞神经分化前后mTOR表达的变化。并初步探讨大鼠骨髓间质干细胞神经分化过程中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)表达的变化及意义。材料和方法实验分五组：骨髓间质干细胞空白对照组、骨髓间质干细胞β-巯基乙醇诱导组、不同浓度雷帕霉素干预骨髓间质干细胞组、不同浓度雷帕霉素干预骨髓间质干细胞+骨髓间质干细胞β-巯基乙醇诱导组、二甲基亚砜(DMSO)阴性对照组,雷帕霉素分3个浓度梯度：10μmol/L20μmol/L30μmol/L。常规体外培养大鼠MSCs,按照5×104cells/well比例接种于24孔细胞培养板,置于37°C、5%C02培养箱内培养。待细胞密度达70%～80%左右加入不同浓度的雷帊霉素处理液(10～30μmol/L),且每组处理液DMSO浓度均低于0.1%,作用24小时。采用免疫荧光法检测诱导前后mTOR在细胞内的分布,激光共聚焦显微镜观察照相；Western Blot法检测诱导前后神经细胞相关蛋白和mTOR通路蛋白的表达。结果1、诱导前mTOR主要在骨髓间质干细胞细胞核内点状分布,细胞质也有少量的分布；诱导后核内荧光信号减弱,mTOR向细胞质转移。雷帕霉素处理后,随着雷帕霉素浓度的提高(10～30μmol/L),核内荧光信号减弱越明显,mTOR向细胞质转移越明显。雷帕霉素浓度超过50μmol/L后,细胞形态变圆,部分细胞脱壁,死亡率显著增加(P<0.05)。2、β-巯基乙醇可诱导骨髓间质干细胞分化为神经细胞,诱导后神经细胞Tau蛋白MAP-2蛋白表达显著增加。雷帕霉素(10～30μmol/L)干预后,随着雷帕霉素浓度(10～20μmol/L)的提高,Tau蛋白、MAP-2蛋白表达逐渐增加,30μmol/L时Tau蛋白、MAP-2蛋白表达下降(P<0.05)。3、Western blot检测结果提示,诱导前后总mTOR表达不变；磷酸化mTOR、磷酸化p70S6K、磷酸化4EBP1诱导后较诱导前表达下降(P<0.05),不同浓度雷帕霉素干预后表达下调更加显著(P<0.05)。结论mTOR在MSCs神经分化过程中由细胞核内向细胞质转移,活性下降,表达下调,且改变nTOR活性可影响MSCs向神经细胞分化。