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目的:EHD2是一类新型膜转运调控蛋白,具有受体内吞及循环调节功能,近来发现转运蛋白具核和膜双重功能,在核中往往参与基因转录调控。个别转运蛋白在响应环境信号介导受体内吞后,直接转移进核,并与染色质重塑蛋白或转录因子结合调控下游基因转录。我们前期结果发现EHD2特异表达于乳腺组织肌上皮细胞核内,癌变时则从核内消失而核外水平上升但总量下降。基于以上研究和结果,本课题为了进一步了解EHD2蛋白序列影响其自身在胞内定位的情况,主要是影响其入核及出核的序列因素,我们以宫颈癌细胞系Hela为模型,通过构建EHD2不同突变的质粒,采用免疫荧光技术,观察EHD2不同突变质粒在Hela细胞内的定位情况,研究影响EHD2入核及出核的相关序列因素,以便为后期研究EHD2的转录调控功能提供基础,并且期望为恶性肿瘤的治疗提供新途径、新靶点。方法:1.构建C端连有HA标签的EHD2野生型和不同突变的质粒。2.用已构建的EHD2野生型、不同突变质粒和包装质粒分别转染293T细胞,制备慢病毒。3、通过慢病毒感染宫颈癌Hela细胞,采用免疫荧光技术检测外源表达的不同EHD2突变质粒在细胞中的定位情况。结果:1.对EHD2的核受体结合序列第184～188位氨基酸中的184和186位进行突变后,EHD2主要定位于胞质。EHD2缺失突变EHD2-1-183aa-HA主要定位于胞质,但延长至EHD2-1-188aa-HA(包括184-188位氨基酸)后,EHD2并未入核,继续延伸至EHD2-1-221aa-HA后,EHD2主要定位于胞核。2.EHD2含有两个NLS序列:第293～299位和535～539位氨基酸。突变第293、299位或突变第535、539位氨基酸后,EHD2主要定位于胞质。并且EHD2的缺失突变质粒 EHD2-73-543aa-HA、EHD2-222-543aa-HA、EHD2-333-543aa-HA和EHD2-438-543aa-HA均主要定位于胞核,EHD2-1-438aa-HA主要定位于胞质。3.EHD2含有一段出核相关序列:第315～329位氨基酸。突变第315～316位或第324位或第327～329位氨基酸后,EHD2均主要定位于胞核。EHD2的缺失突变质粒EHD2-1-314aa-HA主要定位于胞核,延长至EHD2-1-326aa-HA后主要定位于胞质,并且 EHD2 的突变质粒 EHD2-1-326aa-KK315-316AA-HA、EHD2-1-326aa-KK315-316AA-K324A-HA 均主要定位于胞核,EHD2-300-543aa-HA因包括该段序列也主要定位于胞质。其中,EHD2的第315位氨基酸可能为一个SUMO化位点。4.EHD2的第65位氨基酸突变后,EHD2不与膜结合,在胞浆内均匀分布。结论:1.EHD2的第184～188位氨基酸为一核受体结合序列,影响EHD2的入核,但其作用的发挥可能需要其前后序列的补充以构成合适的空间结构。2.EHD2包含两个NLS序列:第293～299位和第535～539位氨基酸,影响EHD2的入核。3.EHD2含有一段出核相关序列:第315～329位氨基酸。其中EHD2的第315～316位氨基酸为一 SUMO化位点,可能通过SUMO化影响EHD2的出核功能。EHD2的第324位和327～329位氨基酸可能为一出核相关序列。4.EHD2的第65位氨基酸影响EHD2与膜结合的能力。