论文部分内容阅读
目的：观察同基因造血干细胞移植治疗多发性硬化动物模型--实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)小鼠的疗效，并通过比较移植前后EAE小鼠外周血T淋巴细胞亚群、脾脏单个核细胞(MNC)中Treg细胞比例及其相关基因Foxp3mRNA和Foxp3蛋白表达水平的变化，探讨其在EAE的发生发展和同基因造血干细胞移植诱导EAE小鼠恢复免疫耐受中的作用。
方法：首先建立EAE小鼠模型，具体为第0天、第7天用含0.3mg MOG35-55的抗原乳化剂于小鼠腹肋部皮下分四点注射；第0天、第2天予0.05ml减毒百日咳杆菌稀释液双足背皮内注射。从第0天起每天进行神经功能评分，于第20天选出神经功能评分≥1分的小鼠作为EAE模型，按评分分层随机化，分为正常鼠-病鼠移植组(18只)、病鼠-病鼠移植组(18只)和病鼠对照组(24只)三组。另以6只正常小鼠设为正常对照组。正常鼠-病鼠移植组、病鼠-病鼠移植组为造血干细胞移植组，于免疫后第22天行CTX200mg/kg腹腔注射和第24天60Coγ射线5Gy全身照射(TBI)的预处理方案，然后分别由尾静脉输入正常小鼠和病鼠的骨髓细胞；病鼠对照组不作处理。正常对照组于移植后120天处死；两移植组小鼠分别于移植后40天(6只)、80天(6只)、120天(6只)处死；病鼠对照组分别于移植前1天(6只)、移植后40天(6只)、80天(6只)、120天(6只)处死。
移植后每3天观察正常对照组和移植后120天处死的正常鼠-病鼠移植组、病鼠-病鼠移植组、病鼠对照组小鼠神经功能评分的变化；取正常对照组和移植前1天处死的病鼠对照组小鼠脑和脊髓行组织病理学检查；用流式细胞仪测定所有小鼠外周血T淋巴细胞亚群；取小鼠脾脏，用流式细胞仪测定脾脏MNC中CD4+CD25+Foxp3+细胞比例，实时定量聚合酶链反应(Real time PCR)测定脾脏Foxp3 mRNA水平，Western blotting法测定脾脏Foxp3蛋白相对表达量。
结果：正常对照组小鼠神经功能评分持续为0。EAE小鼠于免疫后14.88±1.45天发病，表现为精神萎，食欲下降，体重减轻，尾部及后肢无力等，少数出现瘫痪并于数日内死亡，发病率约70％。EAE小鼠的神经功能评分于免疫后第22天左右达峰值，均分为2.35分，此后无明显下降。移植前1天处死的病鼠对照组小鼠的脑和脊髓病理学检查呈弥漫性淋巴细胞浸润和脱髓鞘改变。
移植后40天，正常鼠-病鼠移植组和病鼠-病鼠移植组小鼠神经功能评分较病鼠对照组无统计学差异(P>0.05)，移植后80天和120天时明显下降(P<0.05)。移植后各时段，两移植组之间无明显差异(P>0.05)。
移植前，病鼠对照组小鼠外周血CD4/CD8比值高于正常对照组(P<0.05)；移植后40天、80天、120天时，正常鼠-病鼠移植组和病鼠-病鼠移植组小鼠CD4/CD8比值均低于正常对照组(P<0.05)，两移植组之间无明显差异(P>0.05)。
移植前，病鼠对照组小鼠脾脏MNC中Treg细胞比例为3.3％±1.6％，较正常对照组(6.8％±1.7％)显著降低(P<0.05)，正常鼠-鼠移植组和病鼠-病鼠移植组Treg细胞于移植后40天升高，但未达正常，80d时升高至峰值，分别为16.34％±1.48％和20.12％±2.67％，120天时，两组Treg细胞比例仍高于正常对照组(P<0.05)。移植后各时段，两移植组之间无统计学差异(P>0.05)。病鼠对照组小鼠Treg细胞于移植后40天进一步下降，之后缓慢升高，至80天、120天时与正常对照组无显著差异(P>0.05)。病鼠对照组脾脏Foxp3 mRNA相对表达量也于移植前下降(0.48±0.19)(P<0.05)，移植后40天、80天、120天，正常鼠-病鼠移植组和病鼠-病鼠移植组Foxp3 mRNA均高于病鼠对照组(P<0.05)，两移植组之间无统计学差异(P>0.05)。Foxp3蛋白水平为：移植前的病鼠对照组<正常对照组<移植后120天的移植组。
结论：(1)用MOG35-55免疫C57BL/6小鼠，可诱导慢性单相病程EAE；(2)同基因造血干细胞移植对MOG诱导的EAE小鼠模型有较好的疗效；(3)EAE小鼠发病初期，外周血CD4/CD8比值升高、脾脏Treg细胞的减少、Foxp3mRNA和Foxp3蛋白水平下降，这可能与EAE的发生有关；(4)移植后，EAE小鼠外周血CD4/CD8比值持续倒置、脾脏Treg细胞增多、Foxp3 mRNA和Foxp3蛋白水平增加，这可能是同基因造血干细胞移植诱导EAE小鼠恢复免疫耐受的机制之一；(5)用正常小鼠或用EAE小鼠做供体，对移植的疗效和移植后外周血CD4/CD8比值、脾脏Treg细胞比例、Foxp3 mRNA、Foxp3蛋白水平的变化无影响。