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黑色素瘤是皮肤癌中常见的一种恶性肿瘤。近年来由于环境污染、紫外线辐射、家族史、发育不良的痣、年龄等诸多因素的共同影响,其发病率逐渐增加。恶性黑色素瘤对化疗药物不敏感,且具有耐药性和毒性作用,有必要探索新的治疗方法来治疗黑色素瘤,而靶向治疗是目前黑色素瘤治疗研究的热点。近年来,血小板在肿瘤微环境中的作用受到越来越多的研究者的关注。血小板主要存在血液中,它可通过血小板-肿瘤和血小板-基质相互作用进入肿瘤微环境,血小板可以被用来包裹肿瘤细胞,使其逃避机体的免疫反应,促进肿瘤细胞的侵袭和转移。目的:研究载药血小板载体对黑色素瘤的靶向性及对肿瘤的实验性治疗作用。方法:本研究运用血小板作为药物载体,通过在血小板细胞质中加载DOX并对血小板表面进行转铁蛋白修饰,构建基于血小板的药物递送系统。运用细胞荧光法、流式细胞术研究黑色素瘤细胞对载药血小板载体的摄取及其凋亡分析。将荷瘤小鼠随机分为四组,每组5只,分别为模型对照组、DOX组、P-DOX组、Tf-P-DOX组,利用近红外技术监测荷瘤小鼠体内近红外荧光的分布,HE染色观察组织形态学变化,免疫组化研究载药血小板载体对小鼠肿瘤组织caspase蛋白表达的影响。结果:1.血小板载体的制备及其表征:通过在血小板胞质中加载药物DOX,用转铁蛋白修饰血小板膜表面,构建了血小板载体。通过透射电镜观察血小板的形态,发现未加阿司匹林的血小板伸出伪足呈不规则形状,易于聚集形成血栓,而加入阿司匹林的血小板形成独立的小球。粒径仪结果显示血小板大小分布均匀,载药后无明显变化,说明载药后血小板载体性质稳定。利用荧光显微镜观察血小板中DOX的加载及FITC标记的转铁蛋白在血小板膜表面的结合情况。共定位图像显示构建成血小板载体。DOX浓度为0.05mmol/l时,DOX在P-DOX中的包封效率最高,达到64.9%。在pH 6.5和pH 7.4时,P-DOX的释放量呈时间依赖性逐渐增加,在pH 6.5时,P-DOX释放率达到最大,超过60%。2.黑色素瘤细胞对载药血小板载体的摄取及其凋亡分析:运用FITC/Tf-P-DOX来检测它对正常HUMSC细胞和高表达转铁蛋白受体的B16F10肿瘤细胞的靶向性。荧光显微镜下显示,HUMSC细胞中FITC/Tf-P-DOX的共定位不明显,然而,B16F10细胞对FITC/Tf-P-DOX的摄取显著增加。分别用不同浓度（0.125,0.25,0.5,0.75,1,2μM）的DOX和含有等量浓度的Tf-P-DOX评价对B16F10的细胞毒性。给药24 h时,DOX的IC50值是0.73μM。在接下来的实验中,考虑到Tf-P-DOX的封装效率,用1.13μM Tf-P-DOX（相当于0.73μM DOX）来评价他们对B16F10的细胞毒性。用流式细胞术检测载药血小板载体对B16F10细胞的凋亡作用。结果显示处理24小时后,Tf-P-DOX处理组（41.7%±3.24）细胞总凋亡率与对照组（4.6%±0.42）相比显著升高,P<0.01。3.载药血小板载体在小鼠体内的靶向治疗作用:基于血小板在肿瘤部位的优先靶向和累积,我们在小鼠黑色素瘤模型上进一步研究了载药血小板载体在体内的肿瘤靶向和抗肿瘤作用。在治疗结束后,DOX组小鼠体重（18.58±1.87）较对照组（24.85±1.41）明显减轻p<0.01,P-DOX组小鼠体重（20.81±2.22）与对照组（24.85±1.41）相比有所减轻p<0.05,Tf-P-DOX组（23.14±2.22）小鼠体重与对照组（24.85±1.41）相比无显著差异。小鼠肿瘤生长抑制曲线显示,治疗12天后所有治疗组都抑制了肿瘤的生长。其中DOX组小鼠肿瘤体积（8.54±2.93）较对照组（27.17±3.90）明显减少p<0.001,P-DOX组肿瘤体积（5.54±2.25）与对照组（27.17±3.90）相比明显缩小p<0.001,Tf-P-DOX组肿瘤体积（2.97±1.89）与对照组（27.17±3.90）相比明显缩小p<0.001。体内成像系统显示,荷瘤小鼠近红外荧光主要聚集在肿瘤部位,并且小鼠肿瘤体积逐渐减小。结果显示,与P-DOX组相比,Tf-P-DOX组显示增强的抗肿瘤作用。此外,我们还研究了载药血小板载体在小鼠体内主要脏器中的生物分布。Tf-P-DOX组（0.41±0.34）的心脏荧光强度与P-DOX组（0.91±0.10）相比较弱,p<0.05。DOX组可见心肌组织炎细胞浸润,心肌纤维空泡化和心肌细胞的减少,然而P-DOX组可见心肌细胞减少,伴随纤维组织增生,Tf-P-DOX组心肌组织与对照组相比未见明显损伤。值得注意的是,与对照组相比,Tf-P-DOX组肿瘤组织的形态变化较为严重,包括小的细胞核,癌巢不完整,肿瘤细胞间质有炎细胞浸润。肿瘤组织的免疫组化染色结果显示,caspase 9蛋白在小鼠黑色素瘤组织中的细胞质和细胞核表达。caspase 3蛋白的细胞定位可为细胞质和细胞核。蛋白表达的光密度值显示,与对照组相比,caspase 9和caspase 3蛋白表达水平在DOX组、P-DOX组和Tf-P-DOX组中均有所升高,其中Tf-P-DOX组caspase 9蛋白表达（84.23±24.97）与对照组（16.87±7.63）相比明显升高P<0.01。Tf-P-DOX组caspase 3蛋白表达（74.66±22.08）与对照组（14.97±9.04）相比明显升高P<0.001。结论:综上所述,血小板载体通过与肿瘤细胞膜上的转铁蛋白受体结合,靶向肿瘤,诱导黑色素瘤细胞凋亡。该载体的建立使Tf-P-DOX特异性靶向肿瘤,然后在肿瘤微环境中释放,抑制肿瘤的生长,减少药物在正常组织中的作用,减轻药物毒副反应。