近年来,由于环境变化加剧,对世界范围内的作物生长带来了巨大的影响.据统计,在世界范围内,适于耕种的土地不足10%,大部分土地处于干旱、盐渍、沼泽、冷土等逆境中。因而对植物盐、旱胁迫应答机制进行深入研究,培育耐盐、抗旱作物新品种,是现代农业的一项重要任务。本实验室已通过不对称体细胞杂交方法成功育成世界首例体细胞杂种耐盐、抗旱、高产小麦新品种山融3号,该品种为含有少量供体亲本高冰草遗传物质的小麦渐渗系。本试验通过双向电泳(2-DE)方法获得了山融3号及其亲本普通小麦济南177幼苗根和叶的盐、旱胁迫差异蛋白质组图谱,并利用质谱(MALTI-TOF-TOF MS)技术鉴定了差异表达蛋白质,再采用RT-PCR方法分析这些差异表达蛋白编码序列的表达方式,从蛋白质组学和转录水平上系统分析了杂种及其亲本小麦不同组织器官对盐、旱胁迫的应答特征,探讨了山融3号可能的耐盐、抗旱机制。1.在济南177与山融3号幼苗根中发现了93个差异表达蛋白质,并通过MS鉴定了88个。首先,山融3号与济南177根蛋白质组本身具有差异。在山融3号和济南177根中特异表达的蛋白分别有13个和21个。其次,山融3号和济南177中的盐、旱胁迫诱导蛋白存在显著差异,在鉴定的20个盐、旱诱导型蛋白中,3个在山融3号中被特异诱导,5个在济南177中被特异诱导,其余12个在济南177与山融3号均被诱导;第三,盐、旱胁迫响应蛋白在盐、旱胁迫下的表达模式有较大差异。盐胁迫诱导上调和下调的蛋白数量分别比旱胁迫增加19.2%和11.7%,表明盐胁迫可能引起细胞更剧烈更广泛的胁迫应答过程和更多胁迫响应蛋白的表达变化。而另外一些蛋白如醌还原酶(根90)与翻译起始因子5A3(根74)在济南177根中旱胁迫下表达下调而盐胁迫下被抑制,则表明盐胁迫与旱胁迫的信号转导和效应特征存在一定的差异。第四,根中盐、旱胁迫响应蛋白的表达模式具有品种差异,表现为同种蛋白在济南177与山融3号根中的表达模式不同。如核苷切除修复蛋白(根21)在盐、旱胁迫下济南177根中表达下调而山融3号根中表达不变,醛缩酶(根8)在旱胁迫下济南177根中表达不变而山融3号根中表达上调,盐胁迫下根74在济南177根中的表达被抑止而在山融3号根中的表达下调。表明体细胞杂交改变了胁迫响应蛋白对盐、旱胁迫的应答模式。2.在济南177与山融3号叶中发现了65个差异表达蛋白质,并通过MS鉴定了63个。比较分析显示,它们表现出与根中相似的各种差异。例如:叶中盐、旱胁迫响应蛋白的表达模式也有较大差别:叶绿素a/b结合蛋白CP24前体(叶1)在山融3号叶中旱胁迫下表达上调12.7倍而盐胁迫下表达上调6.1倍,过氧化氢酶(叶23)在济南177叶中盐胁迫下表达被抑止;超氧化物歧化酶(叶51)在济南177叶中旱胁迫下表达上调而盐胁迫下表达不变,这些差异反应了盐与旱胁迫信号途径调节机制的差异。而叶中盐、旱胁迫响应蛋白的表达模式也具有品种差异:如叶绿素a/b结合蛋白CP24前体(叶1)在盐、旱胁迫下济南177叶中表达下调而在山融3号的叶中表达上调,2—半胱氨酸氧还蛋白类似蛋白(叶21)在旱胁迫下的济南177叶中表达不变而在山融3号叶中表达上调,盐胁迫下过氧化氢酶(叶23)在济南177叶中表达被抑止而山融3号叶中表达上调。但是,山融3号与济南177叶蛋白质组间的差异没有根蛋白质组间明显;山融3号和济南177叶中盐、旱胁迫诱导蛋白差异也比根中小,在发现的14个盐、旱诱导型蛋白中,只有1个是山融3号特异性的盐胁迫诱导型蛋白,其余13个在济南177与山融3号中均被盐、旱诱导。3.对28个蛋白(包括25个差异表达蛋白和三个已知的盐胁迫密切相关蛋白SOS1/2/3)进行RT-PCR检验,结果表明:第一,11个蛋白编码序列的转录本在各处理之间没有显著差异,其余17个在各处理间表现出不同的差异表达特征。这表明基因的转录和翻译是两个相对独立的过程,胁迫响应蛋白在转录和翻译水平上的表达特征没有直接相关性,其表达在不同水平上受到多样而立体的调控。第二,在转录水平上没有发现以上根与叶蛋白质组中的品种特异性表达蛋白,也就是说,没有一个蛋白在转录水平是品种特异性的。由此推测,山融3号与亲本济南177的品种特异性蛋白的表达调控主要发生在转录后水平,体细胞杂交抑制某些mRNA翻译成蛋白,而激活另一些原本不能翻译的mRNA产生新蛋白。第三,盐胁迫下在转录水平发生改变蛋白的比例明显高于旱胁迫(根中高7.1-14.3%,叶中高28.6-32.2%),说明盐胁迫能引起细胞更大范围的胁迫应答过程,使更多的胁迫响应蛋白在转录水平发生变化,这与蛋白水平的状况是一致的。4.根和叶中盐、旱胁迫的差异表达蛋白的类型明显不同。1)光合作用相关蛋白差别明显,在叶中占25.81%,在根中没有发现这类蛋白。在根中鉴定了另外3种叶绿体蛋白,分别是谷氨酰氨合成酶叶同工酶,叶绿体前体(根45)、铁氧还蛋白硝酸还原酶,叶绿体前体(根29)、转酮酶,叶绿体(根4),有关这些叶绿体蛋白在根中的作用有待进一步研究。2)抗氧化相关蛋白有较大差异,山融3号根中的品种特异性抗氧化相关蛋白有6个而叶中只有1个。济南177根中的品种特异性抗氧化蛋白有3个而叶中没有。说明根的抗氧化作用远比叶大,而且山融3号的抗氧化能力比济南177强。3)物质转运相关蛋白差异显著。在根中共鉴定了6个而在叶中鉴定了3个。根中的液泡质子ATP酶亚基(根70)和钾离子通道β亚基(根86)在维持液泡质子动态平衡和离子的跨膜运输中具有重要作用。从本实验结果来看,在应对盐、旱胁迫时根的作用比叶大。5.体细胞杂交对小麦蛋白质组产生显著影响:1)体细胞杂交影响叶绿体和线粒体中蛋白质的表达;2)相对于亲本济南177,山融3号中有些蛋白的表达被抑制,同时合成一些新蛋白或使蛋白发生翻译后修饰;3)体细胞杂交改变某些胁迫应答蛋白的表达模式:如脱氢抗坏血酸还原酶(根38)在旱胁迫下,济南177根中表达上调20.3倍而山融3号中表达不变;在盐胁迫下,济南177根中表达上调14倍而山融3号根中表达上调25.1倍。过氧化氢酶(叶23)在旱胁迫下济南177中表达不变而山融3号表达上调7.8倍,在盐胁迫下济南177中不表达而在山融3号中上调表达9.4倍。总之,在蛋白质组水平上,体细胞杂交使小麦幼苗根与叶蛋白质组与转录组发生了全局性变化,使得山融3号光合作用系统、能量转化系统、抗氧化系统以及离子动态平衡调节系统远远优于其亲本济南177。正是这些系统性的变化提高了杂种中由多基因控制的数量性状耐盐、抗旱能力。无论在蛋白质组水平还是在转录水平,盐胁迫与旱胁迫信号途径既有重叠又有区别,表现为一部分胁迫响应蛋白对盐、旱胁迫的应答模式不同。通过根与叶蛋白质组的比较分析表明,根在对抗盐、旱胁迫时能够发挥更重要的作用,根蛋白质组比叶蛋白质组能够更准确地反应植物的耐盐、抗旱能力。