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生物质能源的开发利用是缓解我国能源和环境压力,建立可持续发展能源系统的有效措施。在众多生物中,藻类具有生物量大、生长周期短、易培养以及脂类含量高等特点,是制备生物质能源的良好材料。本实验室选择杜氏藻(Dunaliellabaradawil)作为研究对象,对杜氏藻进行分子生物学改造,将外源编码脂肪合成关键酶-一乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)的α-CT亚基accA基因整合到杜氏藻染色体上,并让目的蛋白大量表达,以期提高杜氏藻该酶合成脂类的能力,从而获得脂类含量高并且能够稳定遗传的杜氏藻株。
本实验克隆了大肠杆菌ACCase的accA亚基,并成功构建原核表达载体pGEX-6P-1-accA,将载体转化到大肠杆菌中,通过SDS-PAGE发现目的蛋白在大肠杆菌中成功大量表达,表达量都占菌体总蛋白的29.4%,主要以包涵体形式存在。
构建表达质粒载体p-accA-CAT,该载体能在原核生物大肠杆菌中大量克隆,又能在真核生物中超量表达,含有报告基因CAT,氯霉素作为抗性标记。使用超声转化、电击转化和基因枪三种转化方法将表达质粒转入杜氏藻中。以accA-因片段两侧序列设计引物对转化藻株的基因组DNA进行PCR扩增并测序,证明目的片段已经进入到宿主细胞中。进行SDS-PAGE,通过凝胶电泳分析发现与预期外源目的基因表达产物大小相当的35KD左右的特异蛋白条带,蛋白扫描结果显示目的蛋白占总蛋白的15.8%,通过Western blot进一步证实了此特异蛋白的存在。基因枪法获得的转化藻株至今都能稳定遗传外源基因,并且转化藻在氯霉素抗性压力下和野生藻的生长速率大致相同,这说明虽然外源基因能够稳定的存在和表达,但是其整合对杜氏藻的正常生长影响并不明显。
尽管外源基因accA能在杜氏藻细胞中稳定存在与表达,但是用索氏提取法测定转化杜氏藻的总脂含量并无明显提高。但本研究结果具有一定理论意义和应用价值,为高油脂藻种培育开辟了一条新技术途径,为以后的转基因研究积累了经验。