[目的]热缺血再灌注损伤是肝移植术后并发症增加以及移植失败的原因之一,尤其是近年来心跳死亡供体（DCD,donation after cardiac death）器官开展应用,将热缺血再灌注损伤的研究提升到新的高度。大量研究发现,ROS,Ca2+负载和细胞免疫,在肝移植早期（6-24小时）可以导致移植肝急性期的损伤。而我们在前期的研究中发现,当移植肝经历急性期损伤后,往往还会出现一段长时间的持续性损伤,具体表现为转氨酶持续性增高,肝细胞凋亡比例增高,并且与热缺血的持续时间有关联,病情进展可以最终发展成移植肝无功能。这种现象常常可以在DCD的肝移植患者术后发现,患者术后常常在1-3天经历急性肝损伤,而在6-11天后,转氨酶可出现再次增高的波动。DCD供肝肝移植术后移植肝出现急性转迟发性损伤的这种过程,目前没有报道以及相关的机理阐明。CaMK Ⅱ是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在Ca2+和钙调素参与下,可发生自身磷酸化,介导多种生理机能的调控。目前的研究发现,CaMK Ⅱ在细胞凋亡,记忆和肿瘤增殖上都有重要的作用。有报道显示,在心脏和平滑肌缺血再灌注损伤研究中,CaMK Ⅱ可以调控线粒体的凋亡,介导相应细胞损伤。而目前对于CaMK Ⅱ在肝移植热缺血再灌注损伤的作用及机制却没有报道。本研究拟通过构建热缺血再灌注损伤的SD大鼠肝移植模型,模拟DCD供体肝移植过程,研究CaMK Ⅱ与持续的热缺血时间之间的关系,以及CaMK Ⅱ与肝功能损伤之间的关系。然后,分别设计细胞实验和动物实验,阐明CaMK Ⅱ的表达如何造成肝脏细胞的损伤,以及CaMK Ⅱ诱导肝脏缺血再灌注迟发性损伤的发生机制。通过对CaMK Ⅱ在热缺血再灌注损伤的肝移植术后机制的研究,探讨DCD供肝肝移植术后出现急性转慢性损伤的病理机制,同时为研究热缺血再灌注损伤提供新的思路和治疗靶点。[方法]1.构建SD大鼠热缺血再灌注损伤肝移植模型。热缺血条件为（热缺血0分钟,热缺血10分钟,热缺血20分钟）,并设立分组。使用Western-blot,q-PCR,免疫组化等检测方式,检测CaMK Ⅱ在不同热缺血时间下的表达,同时检测移植术后第1,3,7天,血液总ALT和AST的表达水平,构建CaMK Ⅱ的表达与肝功能AST和ALT的相关性分析。2.细胞实验验证CaMK Ⅱ的表达对BRL-3A大鼠肝细胞系的影响:通过构建CaMK Ⅱ过表达及干扰慢病毒载体,转染BRL-3A细胞系后,并设立分组:①.生理盐水组（Control）,②.CaMK Ⅱ过表达空载体组（LV-CaMK Ⅱ-NC）,③.CaMK Ⅱ 过表达组（LV-CaMK Ⅱ）,④.CaMK Ⅱ 干扰空载体组（LV-sh-CaMKⅡ-NC）,⑤.CaMK Ⅱ 干扰组（LV-sh-CaMK Ⅱ）。使用 FITC-Annexin V/PI 双染色检测CaMK Ⅱ对BRL-3A细胞系凋亡影响,流式细胞仪检测CaMK Ⅱ对肝细胞周期影响,CCK-8实验检测CaMK Ⅱ对BRL-3A细胞系增殖的影响。之后,通过Western-blot方式检测CaMK Ⅱ对凋亡相关因子AIF和cytochrome c的表达水平影响,验证CaMKⅡ在大鼠肝细胞系中的作用及机制。3.SD大鼠体内实验验证CaMK Ⅱ的表达对SD大鼠肝移植的影响:构建SD大鼠热缺血再灌注损伤的肝移植模型,通过使用CaMKⅡ过表达及干扰慢病毒载体转染SD大鼠肝移植模型,并设置分组:①生理盐水组（Control）,②CaMKⅡ过表达空载体组（LV-CaMK Ⅱ-NC）,③CaMK Ⅱ过表达组（LV-CaMK Ⅱ）,④CaMK Ⅱ干扰空载体组（LV-sh-CaMK Ⅱ-NC）,⑤CaMK Ⅱ干扰组（LV-sh-CaMK Ⅱ）。于肝移植术后第7天使用TUNEL法检测移植肝组织凋亡比例。H&E染色检测移植肝病理变化。并在术后第3天和第7天,检测血液中ALT及AST水平,评估肝功能改变。然后进一步探讨肝移植术后缺血再灌注损伤的机制,通过Flou-3检测肝脏细胞内Ca2+的浓度,JC-10检测肝脏细胞内线粒体膜电势的改变,透射电镜观察线粒体膜及线粒体嵴的改变,通过Western-blot检测移植肝组织内凋亡相关因子AIF和cytochrome c表达水平。最后,使用蛋白芯片,检测干扰CaMK Ⅱ表达后,肝脏组织内差异蛋白的表达水平。[结果]1.通过构建SD大鼠热缺血再灌注损伤肝移植模型发现:SD大鼠术后第7天,CaMK Ⅱ的表达明显较第1,3天高（p<0.05）。同时热缺血时间达20分钟组,CaMK Ⅱ的表达明显较热缺血时间0分钟与10分钟的表达要高（p<0.05）。而且,转氨酶在热缺血再灌注的移植肝模型中,术后第1天明显增高,第3天开始下降,术后第7天再次出现增高。进一步分析发现,移植术后第3,7天CaMKⅡ 的表达与 AST（p=0.001,r=0.748）和 ALT（p=0.043,r=0.495）的表达呈线性相关。2.CaMK Ⅱ对BRL-3A大鼠肝细胞系的影响中发现:过表达CaMK Ⅱ细胞凋亡比例明显增高（p<0.05）,同时细胞增殖明显较对照组减弱（p<0.05）,而细胞周期S期明显较对照组缩短。干扰CaMK Ⅱ的表达后,细胞凋亡较对照组明显减少（p<0.05）,细胞周期S期较对照组明显延长（p<0.05）,细胞增殖较对照组明显活跃（p<0.05）。并且过表达CaMK Ⅱ后AIF和cytochrome c的表达水平较对照组明显增高（p<0.05）3.动物体内实验结果:①TUNEL实验:过表达CaMK Ⅱ后,移植肝细胞凋亡比例较其余4组明显增高（p<0.05）,差异有统计学意义。②H&E病理变化:过表达CaMK Ⅱ后移植肝细胞可见大量嗜酸性肝细胞,同时伴有点状坏死,而干扰CaMK Ⅱ的表达后,移植肝细胞嗜酸性细胞比例明显减少,同时可见细胞出现增殖改变。③肝功能检测:过表达CaMK Ⅱ后,手术后第7天AST和ALT的表达明显较其它4组增高（p<0.05）,而抑制CaMK Ⅱ表达后,AST较对照组明显下降（p<0.05）和ALT的表达较对照组无差别。④Flou-3检测肝细胞内Ca2+浓度:各组之间移植肝细胞内钙离子无明显改变。⑤ JC-10实验检测移植肝细胞内线粒体膜电势改变:过表达CaMK Ⅱ后,线粒体膜电势明显较对照组减低（p<0.05）,有统计学差异。⑥透射电镜观察线粒体超微结构:与对照组相比,过表达CaMK Ⅱ后,移植肝细胞内线粒体膜皱缩,断裂,线粒体嵴排列紊乱,间质水肿。⑦western-blot对凋亡相关因子的检测:过表达CaMKⅡ后,移植肝细胞内AIF和cytochrome c的表达水平较对照组明显增高（p<0.05）,差异有统计学意义。⑧蛋白芯片显示,干扰CaMK Ⅱ后,通过KEGG与GO分析,ERK1/2通路激活。[结论]1.DCD肝移植术后,热缺血时间越长CaMK Ⅱ的表达越高,肝功能的损伤与CaMK Ⅱ的表达呈线性正相关,热缺血再灌注损伤可以导致延迟性的肝功能损伤。2.过表达CaMK Ⅱ,细胞凋亡明显增高,抑制CaMK Ⅱ的表达,细胞出现增殖表现。CaMK Ⅱ诱导肝细胞的损伤与细胞凋亡有关。3.CaMK Ⅱ导致线粒体膜电位下降,通透性增高,引起线粒体水肿,导致线粒体内凋亡相关因子AIF和cytochrome c释放,最终诱导肝脏细胞的凋亡。而抑制CaMK Ⅱ的表达,可能促进ERK1/2通路激活,继而介导肝脏细胞增殖。