目的:糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(diabetes mellitus, DM)重要的慢性微血管并发症之一,以肾小球基底膜增厚、系膜扩张以及胞外基质(Extracellular Matrix, ECM)增生为病理特征,导致肾小球的高滤过和蛋白尿,是引起终末期肾衰的重要原因。肾小球实质细胞,尤其是系膜细胞可分泌和表达多种细胞因子,其中转化生长因子(transforming growth factor, TGF)-β1和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是早期DN发生的关键因子。TGF-β1是ECM的调节剂,其过度表达可导致ECM积聚;刺激足突细胞分泌VEGF。色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor, PEDF)属丝氨酸蛋白酶抑制剂家族,最早由胎儿视网膜色素上皮细胞的培养液中分离出来,是最有效的新生血管抑制剂。PEDF和VEGF的平衡表达是维持眼内血管系统稳态的重要因素。PEDF与体内多个器官功能有关,最近国外一项研究显示,DM大鼠肾脏的皮质和髓质中PEDF都显著下降,肾小球系膜细胞培养显示PEDF可显著下调TGF-β1的表达,可见其是一种与DN发生密切相关的因子。罗格列酮是噻唑烷二酮类(TZDs)药物中的一种,它通过减轻胰岛素抵抗,增强胰岛素敏感性来降低血糖;改善肾小球高滤过状态,调节系膜细胞及肾小管上皮细胞增殖、分化,减少炎症因子产生,纠正脂代谢紊乱,从而发挥肾脏保护作用。除上述作用外,它还有血管保护和抗炎作用。多项国内外临床及基础实验均显示,TZDs可下调肾脏TGF-β1水平,还可以减少VEGF的表达并呈剂量依赖性,这就是其抗炎和血管保护作用的具体体现。由于PEDF在DM大鼠肾脏的异常表达及其在眼部疾病中与VEGF的密切关系,还有最新发现的其抑制TGF-β1表达的作用,推测罗格列酮可通过上调PEDF水平来抑制VEGF和TGF-β1的表达,从而改善肾小球高滤过状态,减少ECM堆积,对DM大鼠的肾脏起到保护作用。因此,本研究通过腹腔一次性注射大剂量链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)的方法,建立1型糖尿病大鼠模型,该模型与人类1型DM的病理过程和代谢特点相似,并给予干预组罗格列酮治疗,在此基础上观察PEDF和TGF-β1在正常大鼠与糖尿病大鼠肾脏表达的变化及罗格列酮的干预作用,从而进一步研究糖尿病肾病的发病机制和罗格列酮对糖尿病的肾脏保护作用。方法:1选择雄性SD大鼠42只,给予标准大鼠饲料适应性喂养1周后,从中随机抽取14只作为正常对照组(NC组),其余作为模型组(MO组)。后者给予腹腔一次性注射大剂量链脲佐菌素(STZ,55mg/kg),破坏胰岛β细胞,建立1型糖尿病模型。于注射STZ后72h,选择空腹血糖(FBG)大于16.7mmol/L者作为1型糖尿病大鼠模型。再把成模大鼠随机分为糖尿病对照组(DM组)、糖尿病罗格列酮干预组(RSG组)。RSG组于成模后第2天开始给予罗格列酮钠(5 mg/kg .d)混悬液灌胃,另外两组予以等体积生理盐水灌胃。实验全程共持续12周,于造模前、造模72小时及实验结束前尾静脉取血测空腹血糖(FBG);实验结束前测体重,并用代谢笼收集24小时尿液,放射免疫分析法测定24小时尿白蛋白排泄量(UAE);于第12周末,股动脉放血处死动物,收集血液,测定血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)、极低密度脂蛋白-胆固醇(VLDL-C)、肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT);酶联免疫分析法测定血清PEDF的浓度;摘取双侧肾脏称重,分别进行病理学HE染色观察肾脏形态学变化,免疫荧光染色观察PEDF和TGF-β1的表达部位及强度;免疫组化的方法检测肾脏PEDF和TGF-β1的蛋白表达情况及表达部位;Western印迹,分析PEDF和TGF-β1在糖尿病大鼠、罗格列酮干预组和正常大鼠肾脏皮质的表达水平。2统计学分析:所有资料以SPSS12.0统计软件进行分析,首先用描述性统计和分析研究变量分布,符合正态分布的测定值以(x±s)表示,两组间的比较采用t检验,多组间的比较采用方差分析。结果:1.DM组和RSG组大鼠造模72小时后,其FBG较NC组升高,差异有显著性(P<0.01)。12周末,DM组和RSG组大鼠FBG较NC组升高,差异有显著性(P<0.01);但这两组大鼠FBG相比较无显著性差异(P=0.52)。2.12周末实验结束时,DM组大鼠肾重、肾重/体重较NC组增加,差异具有显著性(P<0.01,P<0.01);RSG组肾重、肾重/体重较NC组增加,但较DM组降低,差异具有显著性(P均<0.05)。3.DM组大鼠12周末,血清TG、TC、LDL-C、BUN、SCr较NC组升高,差异具有显著性(P<0.05,P<0.05,P<0.05,P<0.01,P<0.01);RSG组TG、TC、BUN、SCr较NC组升高,差异具有显著性(P<0.05,P<0.05,P<0.01,P<0.01),但TG、BUN、SCr较DM组降低,差异具有显著性(P<0.05,P<0.05,P<0.01)。4.DM组大鼠12周后,24小时尿白蛋白排泄量(UAE)较NC组升高,差异具有显著性(P<0.01)。RSG组尿白蛋白排泄量较NC组升高,较DM组降低,差异具有显著性(P<0.01,P<0.05)。5.血清PEDF的含量测定:DM组血清PEDF含量较NC组略有升高,差异无显著性(P=0.15);RSG组较NC组和DM组略有降低,差异无显著性(P=0.75,P=0.19)。6.HE染色结果显示,DM组多数肾小球明显增大,肿胀,充血及肾小球肥大,基底膜增厚,肾小球系膜区增宽,少数肾小球出现轻度硬化;部分肾小管出现细胞空泡变性,管腔变窄。RSG组也有上述变化,但程度较DM组明显减轻。7.免疫组化结果显示,DM组肾组织的PEDF表达较NC组降低,体现在阳性染色的(面密度×阳性单位)值均低于NC组,差异具有显著性(P <0.01),其阳性染色主要分布在肾小球基底膜、小动脉壁、肾小管基底膜上;而RSG组的PEDF表达强度则介于DM组和NC组之间。DM组肾组织TGF-β1的表达较NC组增加,体现在阳性染色的(面密度×阳性单位)值高于NC组,差异具有显著性(P <0.01),其阳性染色主要分布在肾小球基底膜和肾小管间质;而RSG组的TGF-β1表达强度则介于DM组和NC组之间。8.免疫荧光结果显示,DM组肾组织中PEDF的表达较NC组有明显的降低,体现在荧光强度明显减弱,其荧光染色主要分布在肾小球基底膜、小动脉壁;而RSG组的PEDF表达强度则介于DM组和NC组之间。DM组肾组织中TGF-β1的表达较NC组有明显的增加,体现在荧光强度明显增强,其荧光染色主要分布在肾小球基底膜和肾小管间质;而RSG组的TGF-β1表达强度则介于DM组和NC组之间。9.Western印迹显示,DM组大鼠肾脏皮质PEDF的蛋白表达较NC组降低,差异具有显著性(P<0.01)。RSG组PEDF的蛋白表达较DM组升高,差异具有显著性(P<0.05);但较NC组降低且差异具有显著性(P<0.05)。DM组大鼠肾脏皮质TGF-β1的蛋白表达较NC组升高,差异具有显著性(P<0.01)。RSG组TGF-β1的蛋白表达较DM组降低,差异具有显著性(P<0.05);但较DM组升高且差异具有显著性(P<0.01)。结论:1.雄性SD大鼠接受一次性大剂量链脲佐菌素腹腔注射,破坏大部分胰岛β细胞,胰岛素分泌绝对不足,造成持续高血糖状态,在高糖作用下发生肾脏损害,至此建立了1型糖尿病大鼠肾损害模型,此模型可用于研究糖尿病肾脏损害和干预因素对肾脏的直接作用。2.DM组大鼠肾脏PEDF的蛋白表达明显低于NC组,而TGF-β1的蛋白表达则高于NC组,提示肾组织中PEDF及TGF-β1表达的改变与DM肾脏病变密切相关,肾脏PEDF表达的降低可能在DN的发生发展中起重要作用。3.经罗格列酮干预后,糖尿病大鼠UAE明显降低;病理显示肾脏病理损伤减轻;大鼠肾脏TGF-β1的蛋白表达水平降低,PEDF的表达水平升高。因为此次实验使用的为1型DM大鼠,其胰岛β细胞被大量破坏,胰岛素分泌绝对不足,表明罗格列酮除了通过减轻胰岛素抵抗,增强胰岛素敏感性,改善脂代谢来降低血糖外,尚可直接作用于肾脏,降低与DN发生相关的炎性细胞因子,升高具有肾脏保护作用的细胞因子,从而发挥其独特的肾脏保护作用。