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反硝化作用是造成土壤氮素损失的主要途径之一,不仅导致氮肥利用率降低,同时增加温室气体N2O的排放量,破坏大气臭氧层,加速全球气候变暖,对环境产生严重影响。长期施肥对稻田土壤反硝化作用有重要影响,化肥尤其是氮肥的大量投入,促进了反硝化作用,提高了N2O的排放量。以反硝化过程中的关键功能基因——亚硝酸还原酶编码基因（nirK、nirS）为分子标记,探讨施肥对反硝化菌群落多样性的影响,有助于提高稻田系统氮素利用率,减少温室气体排放和环境污染,为稻田生产力可持续性发展提供重要理论依据。本研究利用中国科学院桃源农业生态试验站始于1990年的长期施肥试验,选取不施肥（CK）、施氮肥（N）、平衡施化肥（NPK）、有机肥配施化肥（NPKOM）四种不同施肥处理的土壤样品,利用分子生物学技术,研究了不同施肥处理对水稻土亚硝酸还原酶基因nirK、nirS多样性的影响。研究通过设计简并引物,采用降落式PCR扩增目的基因。目的片段用pGEM-T载体连接,转化至大肠杆菌DH-5α中,通过蓝白斑筛选克隆进行测序。根据测序结果,构建nirK、nirS基因克隆文库,计算多样性指数、绘制Chaol预测曲线,进行LIBSHUFF分析及系统发育分析。主要结果如下:1)长期不同施肥对土壤反硝化速率产生了不同影响,NPKOM处理的反硝化速率显著高于其他三个处理,N处理次之。NPK处理的反硝化速率高于CK处理,但没有显著差异。2)根据Chaol预测分析,长期不同施肥对nir基因多样性的影响不一致。NPK处理比N和NPKOM处理更有利于提高含,nirK基因反硝化菌群落的多样性,而N处理使nirS基因的多样性显著提高。3)利用LIBSHUFF方法分析不同施肥的基因文库差异,发现nirK基因四个处理间两两比较的差异都达到显著水平,而nirS基因的处理间则无显著差异。表明长期施肥明显改变了含nirK基因的反硝化菌的群落结构,对nirS基因群落结构影响较小。4)本研究克隆的249个nirK基因序列有232个与NCBI数据库中已知nirK基因片段相似,nirS基因克隆只有79%与已知序列相似。nirK基因序列与数据库中未知菌种的nirK基因相似性较高,为80%～95%,平均达90.7%;而nirS基因片段与数据库中已知的nirS基因相似度低,为72%～82%,平均为74.7%。因此无法判断本研究克隆得到的nirK、nirS基因片段所属的菌种。系统发育分析结果显示,nirK基因的OTUs可分为8个大簇,且不同处理下的OTUs有聚集情况,表明施肥改变了nirK反硝化菌群落中优势种的分布。大多数nirS基因克隆聚集在一个主要的大簇中,不同处理的OTUs分布则较平均,无明显的聚集情况,显示其群落的稳定性。总体来说,长期不同施肥对水稻土nirK、nirS基因反硝化菌群落多样性的影响不一致,平衡施化肥明显提高nirK基因多样性,单施氮肥使nirS基因多样性达到最高,其他施肥处理对nir基因多样性的影响不显著。施肥明显改变了nirK基因群落的结构组成,但对nirS基因群落结构无显著影响;nirK基因群落结构对施肥处理的敏感度大于nirS基因。