胶质瘤是中枢神经系统中最常见的原发性恶性肿瘤,具有高发病率和低生存率的特点,虽然目前先进的诊断技术和包括手术、放疗、化疗联合治疗技术得到了长足的发展,但高级别胶质瘤患者的临床预后仍较差,其中胶质母细胞瘤患者的平均生存期仅为12-14.6个月,5年存活率不到3%。研究发现,生物分子学因素参与了胶质瘤的发生发展及预后。因此,探讨能够为胶质瘤基因治疗提供依据的新型分子靶点至关重要。HOX基因是一类存在于真核生物中具有高度保守性的转录调节因子,分为HOXA、HOXB、HOXC、HOXD 4簇,又根据染色体的位置及簇间基因相似性分为39个基因。HOX基因均含有可编码同源结构域的保守序列,其表达的蛋白可识别5￠-TAAT-3￠为核心的10-12 bp的DNA序列并与之特异性结合,不但可调控胚胎细胞的增殖分化,而且在成熟细胞分化中起到重要的积极/消极监控作用。HOX基因表达水平的失调可导致个体发育的形态结构异常,也可以通过改变凋亡相关蛋白或信号通路导致包括胶质瘤在内的肿瘤的发生发展。HOXA4、HOXB1作为同源异型盒基因家族的一员在不同肿瘤的发病机制中起到了重要的作用,但在人胶质瘤中的表达以及调控机制仍不清楚。本课题将通过二部分实验对HOXA4、HOXB1在人胶质瘤中的表达情况、临床意义、生物学行为影响及相关调控机制进行研究。第一部分HOXA4在胶质瘤中作为癌基因通过Wnt/β-catenin信号通路促进增殖,抑制凋亡目的:探讨HOXA4在人胶质瘤中表达水平以及与胶质瘤患者预后的关系,并通过HOXA4对胶质瘤细胞恶性生物学行为的影响进一步分析相关调控机制。方法:(1)通过生物信息学GEO、CGGA数据库初步分析HOXA4在人胶质瘤中表达情况;q RT-PCR和IHC检测40例人胶质瘤组织及8例正常脑组织的HOXA4 m RNA及蛋白表达水平;q RT-PCR和Western bolt检测人胶质瘤细胞株A172、U251、U87和人星形胶质细胞HA1800中HOXA4 m RNA及蛋白表达。(2)c2检验分析HOXA4与胶质瘤患者临床病理特性的关系;Kaplan-Meier法分析HOXA4与胶质瘤患者生存率的关系;Cox回归模型分析HOXA4与胶质瘤患者预后的关系。(3)体外通过MTT实验、细胞克隆实验、Transwell实验、划痕实验、流式细胞术分析HOXA4对胶质瘤细胞增殖、侵袭、周期和凋亡的影响;体内通过裸鼠皮下荷瘤模型分析HOXA4对胶质瘤生长的影响。(4)通过Western bolt和IHC方法体内外检测HOXA4对Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白β-catenin、DVL2、Gsk3β、Cyclin D1和P53表达的影响。结果:(1)HOXA4作为癌基因在人胶质瘤中高表达,与胶质瘤的恶性程度呈正相关。(2)胶质瘤患者HOXA4表达水平与患者生存率及预后密切相关。(3)HOXA4能促进胶质瘤增殖、侵袭,抑制凋亡。(4)Western bolt和IHC体外和体内检测显示HOXA4表达抑制后β-catenin、DVL2和Cyclin D1蛋白表达水平明显下降,Gsk3β和P53蛋白表达水平明显升高。结论:HOXA4作为癌基因在人胶质瘤中表达水平明显升高,并与胶质瘤的恶性程度呈正相关。HOXA4高表达的胶质瘤患者预后较差,并且HOXA4表达水平为胶质瘤患者预后的诊断因素。HOXA4可通过参与Wnt/β-catenin信号通路促进胶质瘤细胞增殖、侵袭,抑制凋亡。第二部分HOXB1在人胶质瘤中作为抑癌基因受mi R-3175调控目的:探讨HOXB1在人胶质瘤中表达水平以及与胶质瘤患者预后的关系,通过研究HOXB1和mi R-3175对胶质瘤细胞恶性生物学行为的影响进一步分析两者靶向调控机制。方法:(1)通过生物技术信息学GEO、CGGA数据库初步分析HOXB1在人胶质瘤中表达情况;q RT-PCR和IHC检测40例人胶质瘤组织及8例正常脑组织的HOXB1表达;q RT-PCR和Western bolt检测人胶质瘤细胞株A172、U251、U87和人星形胶质细胞HA1800中HOXB1表达。(2)c2检验分析HOXB1与胶质瘤患者临床病理特性关系;Kaplan-Meier法分析HOXB1与胶质瘤患者生存率关系;Cox回归模型分析HOXB1与胶质瘤患者预后关系。(3)通过MTT实验、Transwell实验、划痕实验、流式细胞术分析HOXB1对胶质瘤细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。(4)生物信息学分析靶向调控HOXB1的上游mi RNA;通过q RT-PCR分析mi R-3175在人胶质瘤中的表达水平;通过MTT实验、Transwell实验、划痕实验、流式细胞术分析mi R-3175对胶质瘤细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。(5)荧光素酶报告基因系统检测mi R-3175对HOXB1 3′-UTR的调控作用;q RT-PCR和Western blot分析mi R-3175在人胶质瘤细胞株(A172、U251、U87)中对HOXB1表达的调控作用;Spearman相关性分析人胶质瘤组织中HOXB1和mi R-3175表达的关系。(6)MTT实验、流式细胞术检测mi R-3175对低表达HOXB1致瘤性细胞增殖、凋亡方面的调控作用;Western bolt检测mi R-3175对低表达HOXB1致瘤性相关凋亡蛋白Procaspase-3、P53和Cytochrome C表达的影响。结果:(1)HOXB1作为抑癌基因在人胶质瘤中低表达,并与胶质瘤的恶性程度呈负相关。(2)胶质瘤患者HOXB1表达水平与患者生存率及预后密切相关。(3)HOXB1能抑制胶质瘤增殖、侵袭,促进凋亡。(4)mi R-3175在人胶质瘤中表达水平升高,可促进胶质瘤增殖、侵袭,抑制凋亡。(5)荧光素酶报告基因系统分析发现mi R-3175可通过3′-UTR碱基互补作用于HOXB1基因靶点,并且高表达mi R-3175可下调HOXB1 m RNA及蛋白表达水平,低表达mi R-3175可上调HOXB1 m RNA及蛋白表达水平;Spearman相关性分析发现人胶质瘤组织中HOXB1与mi R-3175呈负相关(R=-0.466)(6)MTT实验、流式细胞术检测发现mi R-3175表达抑制后可显著阻止胶质瘤细胞低表达HOXB1增殖促进作用和凋亡抑制作用;Western bolt检测发现mi R-3175表达抑制后逆转胶质瘤低表达HOXB1的致瘤性后Cytochrome C和P53蛋白表达水平明显升高,Procaspase-3蛋白表达水平明显下降。结论:HOXB1在人胶质瘤中表达水平明显下降,作为抑癌基因能抑制胶质瘤细胞增殖、侵袭,促进凋亡。HOXB1低表达的胶质瘤患者生存期较差,并且HOXB1表达水平为胶质瘤患者预后的诊断因素。mi R-3175在人胶质瘤中表达水平明显升高,能促进胶质瘤细胞增殖、侵袭,抑制凋亡,并且可直接调控靶基因HOXB1的表达水平。mi R-3175表达抑制可有效阻止胶质瘤中低表达HOXB1的致瘤性。