纳豆激酶(nattokinase，NK)是由纳豆芽孢杆菌(Bacillusnatto)或纳豆枯草杆菌(Bacillussubtilisnatto)分泌的一种具有强烈纤溶作用的丝氨酸蛋白酶。体内外实验证明该酶能显著溶解体内外血栓，明显缩短纤维蛋白的溶解时间。并具有激活静脉内皮细胞产生组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)，降解和失活纤溶酶原激活剂的抑制剂(pAI-1)和催化尿激酶原转变成尿激酶等功能。动物实验和人体志愿者实验表明，纳豆激酶经口服后可迅速入血，纤溶活性强，作用时间长，具有安全性好、口服有效等优点。 本研究第一部分内容是克隆了纳豆激酶基因。用PCR的方法从纳豆芽孢杆菌基因组DNA中，克隆了包括编码信号肽、前导肽和成熟肽序列的纳豆激酶基因。基因测序结果表明，本研究克隆的纳豆激酶基因和Nakamura报道的Bacillussubtilisvar.nattosubtilisinNAT(aprN)gene(genbank登录号：S51909)序列完全一致。 本研究第二部分内容是在大肠杆菌中表达了纳豆激酶基因并制备了抗纳豆激酶多克隆抗体。把纳豆激酶基因克隆到大肠杆菌表达载体pET28a+的BamHI和XhoI位点上，并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了纳豆激酶基因。SDS-PAGE分析表明，在大肠杆菌中表达的纳豆激酶融合蛋白分子量约为31kD。表达产物通过HiTrapTMChelatingHP亲和层析柱纯化。纯化产物与弗氏佐剂混合研磨制备了乳化疫苗，皮下多点免疫新西兰大白兔，制备了抗纳豆激酶抗体血清。抗体血清用ProteinA亲和凝胶柱纯化。用琼脂板双向扩散实验初步检测了抗体滴度。ELISA间接法测得抗体滴度大约为1∶16000，Westernblotting检测含重组质粒的大肠杆菌总蛋白和纯化的纳豆激酶融合蛋白都有一条特异的条带。 本研究第三部分内容是在家蚕杆状病毒表达载体系统中表达了纳豆激酶基因。把纳豆激酶基因克隆到家蚕杆状病毒表达载体系统转移载体pBacPAK8的EcoRI和BamHI酶切位点之间，获得重组转移载体pBacPAKNK。将重组转移载体DNA和线性化的Bm-BacPAK6病毒DNA共转染BmN细胞，通过3轮空斑筛选获得纯化的重组病毒Bm-BacPAKNK。Bm-BacPAKNK感染BmN细胞，收集不同感染时期的培养基和上清，SDS-PAGE和Westernblotting分析表明，纳豆激酶基因在家蚕细胞中成功得到表达。表达产物是经过剪切和修饰的去掉了信号肽和前导肽的28kD纳豆激酶成熟肽蛋白。重组病毒Bm-BacPAKNK接种五龄家蚕起蚕，每隔24h收集蚕血淋巴，待大部分蚕出现明显病毒感染症状后大量收集蚕血淋巴。Westernblotting检测纳豆激酶在家蚕幼虫中得到表达，表达产物分子量在28kD左右，和纳豆激酶成熟肽分子量一致。ELISA检测结果表明：在病毒感染后120h蚕体中纳豆激酶表达量最高，达40μg/ml蚕血淋巴。表达产物用Seizeprimaryimmunoprecipitationkit纯化，纯化的蛋白分子量约28kD。 本研究第四部分内容是家蚕杆状病毒表达系统表达的纳豆激酶动物口服实验。40只大鼠分为5组，设置为灌胃重组纳豆激酶高、中、低剂量组，阳性对照组和阴性对照组。每日灌胃一次，共20d。在第10d和20d剪尾取血，用发色底物法测得灌胃纳豆激酶高、中、低剂量组大鼠血液中t-PA比阴性对照组明显增高(p＜0.01)。大鼠血浆中PAI-1浓度低于阴性对照组(p＜0.05)。提示口服家蚕杆状病毒表达系统表达的纳豆激酶可通过激活大鼠自身的纤溶系统，从而达到溶栓的目的。 本研究第五部分内容是在家蚕杆状病毒表达系统中表达并纯化了融合六个组氨酸的人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)。将融合六个组氨酸(6×his)序列的hGM-CSF基因插入杆状病毒转移载体pBacPAK8中得到杆状病毒重组转移载体pBacPAKHis-GM-CSF，pBacPAKHis-GM-CSFDNA与线性化病毒Bm-BacPAK6DNA共转染BmN细胞，获得了表达rhGM-CSF融合蛋白的重组病毒vBacPAKHis-GM-CSF。用重组病毒感染家蚕五龄起蚕，分别在24h、48h、72h、96h、120h和144h剪腹足取蚕血淋巴，ELISA法测得rhGM-CSF融合蛋白在120h的蚕血淋巴中表达量最高，约为15μg/mL蚕血淋巴。融合蛋白通过Poly-HisProteinPurificationKit纯化。SDS-PAGE和Westernblotting分析表明，表达产物是三种糖基化程度不同的，分子量分别约为18、20、31kD的蛋白质。