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目的微/纳米双重等级结构组织修复支架为细胞长入提供微纳米触点,调控细胞行为,诱导细胞分泌具有等级结构的细胞外基质,从而实现组织的结构性再生与重建。本研究结合Ⅰ型胶原(COL-Ⅰ,CollagenⅠ)自组装、静电纺丝技术和生物界面交联技术,构建拟生态的微/纳米等级性纤维支架,实现硬脊膜的再生重建,阻止硬膜外组织疤痕形成。方法首先制备L-聚乳酸((PLLA)与丝素蛋白(SF,Silk fibroin)的静电纺丝纤维膜,再进行聚多巴胺(PDA)涂层,酸性COL-Ⅰ溶液于PDA修饰的静电纺丝支架上进行自我组装,形成COL-Ⅰ纳米纤维网,采用聚多巴胺(PDA)界面交联反应技术能促进天然COL-Ⅰ纤维与合成、天然纤维形成稳定的共价结合,维持微/纳结构性支架的稳定性。通过扫描电子显微镜(SEM)、原子力显微镜(AFM)、X射线光电子能谱分析(XPS)、水接触角(WCA)等方法对支架材料进行表征;CCK-8检测成纤维细胞的在支架上黏附和增殖;免疫荧光检查培养于微/纳米支架上成纤维细胞骨架形态与分布,COL-Ⅰ、整合素受体integrin-β1、α-SMA表达。建立兔脊柱硬脊膜缺损模型,采用生物相容性良好的天然丝素蛋白为基质的微/纳纤维支架进行脊柱硬脊膜的缺损修复。实验动物分组:SF-PDA-COL纤维支架组;SF-PDA纤维支架组;SF纤维支架组;无植入物组,仅建立硬脊膜缺损。使用MRI和大体标本观察、组织病理切片及免疫组化等方法评估硬脊膜再生及硬膜外疤痕组织形成等情况。结果通过SEM及AFM观察到PLLA及SF的微米级的电纺纤维与COL-Ⅰ组装形成的纳米纤维构成了双重网络等级性的微/纳纤维结构,较PLLA、PLLA-PDA、SF,SF-PDA纤维支架有明显的结构性差异。XPS检测证实COL-Ⅰ均能够稳定地与PLLA和SF电纺纤维膜结合。WCA试验表明PLLA与SF电纺膜通过PDA涂层胶原自组装修饰后支架的亲水性明显增加。在含有胶原纤维的等级性的微/纳纤维支架上贴壁的成纤维细胞伸展、细胞骨架良好、成融合性生长;细胞数量及贴壁细胞的面积较PLLA、PLLA-PDA、SF、SF-PDA等支架上明显增多,免疫荧光检查进一步证实天然三股胶原纤维能够刺激成纤维细胞整合素受体integrin-β1的活性,促进细胞外基质Ⅰ型胶原的沉积,并能够有效抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞分化。动物体内试验进一步证明双重网络等级纤维结构支架能够有效促进硬膜组织再生,并抑制硬膜外疤痕形成。结论我们构建了高度仿生的微/纳米双重等级结构支架。这一连续的双重网络等级纤维结构,能够实现细胞-基质材料之间的相互作用,调控细胞的增殖、分化等生物学行为,并能实现硬脊膜的仿生重建,抑制硬膜外疤痕形成。目的研究探讨静电纺丝纤维支架的拓扑结构,化学组份,纤维的密度等理化性质对细胞行为的影响;构建异质性双层结构的静电纺丝纤维膜,膜的内层结构为取向或无规SF和COL-Ⅰ的混合纤维,通过调控纳米纤维拓扑结构或化学组份,促进硬脊膜的愈合,支架的外层为SF无规电纺纤维,通过调控SF纤维的密度及孔径,抑制成纤维细胞的黏附及长入,阻止硬膜外疤痕组织形成。方法制备不同比例的SF与COL-Ⅰ混合的静电纺丝纤维膜,纤维膜具有取向(ASCF)与无规(RSCF)两种不同的拓扑结构,制备不同纤维密度的的SF无规结构的纤维膜(RSF)。使用SEM观察不同的静电纺丝纤维膜的结构与形态特征;流式细胞仪检测培养于ASCF及RSCF支架上的成纤维细胞激活的integrinβ1受体的表达;SEM及细胞骨架染色观察培养于不同的纤维支架上的黏附、细胞形态,细胞骨架的重塑,细胞铺展面积;CCK-8检测细胞的在支架上的增殖;Vinculin、α-SMA、Ⅰ型胶原、YAP免疫荧光检查细胞在不同的纤维支架上的黏附、黏着斑(Focal adhesion)形成、细胞表型分化、细胞外基质的产生、YAP的激活核定位情况。制备异质性的双层纤维支架,内层为取向或无规SF/COL-Ⅰ纤维,外层为无规的SF纤维,检测双层支架的力学性质并用SEM表征双层支架的微结构与形貌特征。SEM及细胞骨架染色观察双层纤维支架对细胞行为的影响。使用兔脊柱椎板切除,硬脊膜缺损模型验证双层异质性静电纺丝纤维支架对硬脊硬膜缺损的再生修复以及阻止硬膜外组织疤痕形成的效果。动物分组,正常组:未手术组(Normal);无支架材料植入组:建立动物硬脊膜缺损模型,但无支架材料植入,空白对照组(Control);植入双层支架组(内层为无规的SF/COL-Ⅰ纤维,外层为SF纤维)(D-RSCF/RSF);植入双层支架组(内层为取向的SF/COL-Ⅰ纤维,外层为SF纤维)(D-ASCF/RSF)。使用MRI和大体观察、组织病理切片及免疫组化等方法评估硬脊膜再生及硬膜外疤痕形成等情况。结果SEM结果示ASCF、RSCF及RSF纤维膜表面结构均匀、平滑;ASCF支架纤维结构规整,定向平行分布排列,RSCF及RSF支架纤维排列方向杂乱无序,相互交织成网。流式细胞仪检测示ASCF相对于RSCF支架能明显抑制成纤维细胞Integrinβ1受体的激活;SEM及细胞骨架染色结果显示ASCF支架能够促进成纤维细胞的骨架重塑,细胞形态定向拉长,呈纺锤形,RSCF支架的成纤维细胞明显铺展,无规分布,形成较大的板层状伪足,随着胶原比例的增加两种支架上的细胞铺展面积均有增加,但相同胶原比例RSCF支架细胞铺展面积明显大于ASCF支架。随着RSF密度的增加,肌成纤维细胞的形态由无规的扁平状,变成圆形或椭圆形,细胞黏附数量及面积均明显减小。CCK8结果显示静电纺丝纤维中COL-Ⅰ活性成份能够明显促进细胞的增殖,而纤维支架的拓扑结构减缓了成纤维细胞的增殖速率,RSF密度增加能明显抑制肌成纤维细胞的增殖。免疫荧光检查证实了纤维的拓扑结构与化学组份能够改变细胞的骨架重塑,黏附状态以及黏着斑的形成与分布,而静电纺丝纤维的拓扑结构促进成纤维细胞产生定向分布的细胞外基质COL-Ⅰ,并能保留成纤维细胞的静止表型,抑制其向肌成纤维细胞表型分化,肌成纤维细胞的激活α-SMA应力纤维的形成与YAP的核定位有密切的关系。异质性双层结构具有良好的生物相容性及机械力学性能。动物体内实验结果进一步证实双层异质性的纤维支架(D-ASCF/RSF)能够有效促进硬脊膜再生的同时,抑制硬膜外组织疤痕形成。结论SF/COL-Ⅰ混纺纤维支架的拓扑结构,化学组份能够促进细胞增殖与表型分化,而静电纺丝纤维拓扑结构更有利于保留成纤维细胞的静止的表型;SF纤维的密度抑制肌成纤维细胞的黏附与增殖;异质性双层结构的静电纺丝纤维膜,能够有效促进硬脊膜愈合,阻止缓解硬膜外疤痕的形成。