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采后酶促褐变是双孢蘑菇生产销售的氨酸酶主要瓶颈。随着分子生物学技术的进步，采用RNAi技术对双孢蘑菇褐变的关键酶--酪基因，进行沉默研究，可以为双孢蘑菇褐变的抑制、种质改良以及基因功能研究奠定基础。本研究：通过RT-PC R克隆双孢蘑菇酪氨酸酶基因，分析酪氨酸酶基因家族的多样性；构建以双孢蘑菇gpd启动子高效启动的RNAi基础表达载体；以双孢蘑菇酪氨酸酶基因铜离子结合区为对象，通过构建酪氨酸酶基因的RNA干扰载体，经农杆菌介导转化，对双孢蘑菇酪氨酸酶基因进行RNA干扰研究。本研究主要取得了如下结果： (1)根据NCBI报道的双孢蘑菇的多酚氧化酶基因，设计特异性同源引物，通过RT-PCR的方法，先后克隆得到了双孢蘑菇2796菌株的酪氨酸酶基因(TYE1、TYE2、TYE3、TYE4)，cDNA长分别为1539 bp，1645 bp，1799 bp，1950 bp，推导其编码氨基酸的数量分别为492、550、576、611个，等电点分别为6.58，6.92，5.14，5.87；预测其分子量大小分别为63.88，63.92，66.26，68.34 kDa.通过比对推导的氨基酸序列，发现都有预期的Cu离子结合区。利用生物信息学方法对克隆得到的酪氨酸酶基因进行分析，发现该4条基因编码的氨基酸没有明显的疏水区域，为亲水性氨基酸；氨基酸序列内不存在信号肽，是非分泌蛋白；TYE1、2、3没有明显的跨膜区，在细胞质内合成，TYE4末端有跨膜区，结合在细胞器膜上，但不进行蛋白转运。 (2)以植物表达载体pCAMBIA1301+35S为基础骨架，通过PCR设计加接头引物，克隆了双孢蘑菇3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(3gpd)、潮霉素表达框(hygro)、大肠杆菌β-葡萄糖醛酸酶基因(GusA)内含子的一段序列、构巢曲霉色氨酸合成基因(trpC)终止子等载体元件；经过酶切、连接、转化及提质粒等试验方法，用构巢曲霉色氨酸合成基因终止子(trpC)换去载体pCAMBIA1301+35S从PstⅠ到BstEⅡ之间的序列；用双孢蘑菇3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(3gpd)和潮霉素表达框(hygro)换去载体pCAMBIA1301+35S的启动子和潮霉素表达框序列；接着用3gpd启动子换去多克隆位点(MSC)上游的启动子CaMV35S；之后将大肠杆菌β-葡萄糖醛酸酶基因(Gus A)长325bp的片段插入到多克隆位点后，最终形成GusA两侧含多克隆位点(MSC区)，以双孢蘑菇3gpd强启动子启动潮霉素和RNAi表达框的RNAi基础表达载体pghTGg。 (3)克隆酪氨酸酶基因(TYE)，通过设计不同接头，将其正向插入到载体pghTGg的多克隆位点MSC001处，反向插入到多克隆位点MSC002处；形成在3gpd强启动子启动下，以GusA为中间间隔区，TYE核心区正反义片段为茎的茎环结构(Stem-loop)，又叫发夹结构(hairpin)，该发卡结构是实现沉默酪氨酸酶基因沉默的关键。 (4)对双孢蘑菇2796进行潮霉素抗性试验，确定潮霉素致死浓度在50μg/mL～60μg/mL之间。据此将农杆菌转化的初筛浓度定为40μg/mL，复筛浓度定为60μg/mL。针对AS的浓度、共培养时间及侵染时间3个转化条件进行优化，确定本实验采用的最优AS浓度为300μmol/L，共培养时间为3天，侵染时间10～20 min。 (5)在农杆菌介导下，将质粒pghg-sense-G-antisense-T转化双孢蘑菇2796菌株菌褶，对经潮霉素和PCR筛选及鉴定的转化子进行生物学性状比较，发现转化子的生长代谢速率明显慢于野生菌株；菌丝酪氨酸酶酶活维持在较低水平，在30天总酶活的水平上，干扰效率达到45.5％。 (6)对DNA提取方法进行了改进，总结出了不用热水浴，省时，有毒试剂使用量少的新方法。