真菌多糖作为天然活性生物大分子,在生物医药、日用化工等领域已经受到人们的广泛关注。藏红花在抗肿瘤,增强免疫力,降血脂,抗高血压,抗抑郁,抗炎等都很好的药理活性。已有研究表明藏红花多糖不仅对人子宫癌He La细胞有很强的细胞毒性,还能促进巨噬细胞的活性。但是藏红花是柱头入药,且栽培条件很难控制,因此产量很低,满足不了市场的需求。前期基础工作已经通过活性筛选发现藏红花内生真菌CSL-27多糖有很强的抗氧化活性和良好的抗肿瘤活性。因此本文系统地对该多糖的提取、分离、纯化及其结构片段、生物活性等进行研究。主要研究包括:第一部分:利用响应面法结合星点设计考察藏红花内生真菌CSL-27多糖的醇沉提取工艺。首先进行单因素实验,以多糖得率为指标,分别对醇沉时间,醇沉温度,最终pH和液料比进行考察,得到醇沉时间16 h,醇沉温度4°C,最终pH 7和液料比(95%乙醇与发酵液的体积比)为4:1(L/L),以此条件为星点设计的中心点设置三个水平,再结合响应面法进行试验分析。得到最佳醇沉条件为醇沉时间16 h,醇沉温度3.7°C,最终pH 7.2和液料比为5:1(L/L)并进行验证实验,多糖得率为162μg/L,与预测值165μg/L相近,说明该工艺能有效提高多糖的提取率,为多糖深入研究提供基础。第二部分:运用柱层析分离纯化藏红花内生真菌CSL-27多糖以及化学结合仪器的方法研究多糖的理化性质和EPS-2的结构。藏红花内生真菌CSL-27多糖溶液,先经Sevag试剂脱蛋白,大孔树脂AB-8脱色,透析和冻干等步骤处理后,再用DEAE-52纤维素柱层析分离,得到两个多糖片段EPS-1和EPS-2,最后两个多糖片段再经葡聚糖凝胶G-75柱层析洗脱后曲线为单一对称峰。以葡萄糖标准品作标准曲线,苯酚硫酸法测得EPS-1和EPS-2的糖含量为46.60%和28.89%。高效液相色谱分析法测定EPS-1的单糖组成,含有甘露糖、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖,对应的比例是2.3:1.0:1.1:1.4;EPS-2的单糖组成含有甘露糖、葡萄糖和阿拉伯糖,对应的比例是9.2:6.4:1.0。高效液相凝胶排阻色谱出峰分布均一,表明多糖EPS-1和EPS-2都为均一多糖,分子量分别为29409和40427。EPS-2的紫外光谱显示在260 nm和280 nm处均无吸收峰,说明不含核酸和蛋白。红外光谱分析结果表明,EPS-2在3367 cm-1,2939 cm-1,1131 cm-1和1056 cm-1处的吸收峰均是多糖的特征吸收峰,结构中可能含有β-D-吡喃环和α-糖苷键。扫描电镜显示EPS-2表面凹凸不平,有大量褶皱及空隙存在,这些都说明EPS-2结构的复杂。GC-MS分析得到四个不同类型的糖残基片段,分别为1→6)-β-D-葡萄糖、1→)-α-L-阿拉伯糖、1→2,4)-α-D-甘露糖和1→)-α-D-甘露糖,对应摩尔比例为6.25:1.00:4.47:6.32。最后结合核磁共振波谱确定片段的连接顺序,得到重复单元结构的主链由1→6)-β-D-葡萄糖,1→2,4)-α-D-甘露糖组成,支链由1→)-α-L-阿拉伯糖和1→)-α-D-甘露糖组成。第三部分:利用MTT法体外评价多糖EPS-2的抗肿瘤活性和免疫活性。通过考察多糖EPS-2分别对人慢性髓原白血病K562细胞、人肺癌A549细胞、人早幼粒白血病HL-60细胞和宫颈癌HeLa细胞的抑制作用来评价其抗肿瘤活性。实验结果显示在剂量浓度(0~5 mg/m L)范围内,EPS-2对K562,HL-60和A549三株细胞的增殖无显著的抑制作用,而在0.5 mg/m L时对HeLa细胞的增殖就具有一定的抑制作用。与前期工作的藏红花内生真菌CSL-27多糖的抗肿瘤活性结果存在差异的原因,可能是多糖中的色素和EPS-1对其抗肿瘤活性也有一定的作用。巨噬细胞作为免疫效应细胞在免疫应答中发挥着重要作用,因此可通过研究多糖EPS-2对小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7的促增殖活性来评价EPS-2的免疫活性。实验结果表明在剂量浓度(0~5 mg/m L)范围内,EPS-2对小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7细胞都没有促增殖活性,免疫活性低,可能是EPS-2不与巨噬细胞RAW264.7表面的受体结合,不能促进炎症因子的分泌而无法发挥免疫活性。