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一、研究背景胃癌（Gastric cancer,GC）是全球第三大癌症死亡原因。腹腔转移是胃癌患者术后最常见的转移方式。根据经典的―种子与土壤‖学说,脱落的癌细胞从原发灶到腹腔后存活是胃癌腹腔转移的重要环节。脱落癌细胞常以两种形式存在,一为单个、散在游离的癌细胞,二为多个脱落癌细胞彼此粘附聚集形成类球状紧密围绕的多细胞团簇或多细胞球（multicellular aggregates/spheroids,MCAs/MCSs）。腹腔转移需要面临的特殊微环境是氧气缺乏和血液供应不足,散在的肿瘤细胞经常会出现失巢凋亡,而肿瘤多细胞团簇却可悬浮生长于腹腔微环境中。所以胃癌MCAs是腹腔转移的主要种子细胞,但其存活机制尚不清楚。我们研究发现,胃癌MCAs具有肿瘤干细胞样表型的生物学特性,包括自我更新能力、相关肿瘤干细胞标记物的表达和裸鼠致瘤能力。因此,我们进一步检查了其维持肿瘤干细胞样表型的机制。经典的Hedgehog-GLI信号通路在肿瘤干细胞的调控中发挥了重要作用。GLI1不仅是经典的Hedgehog（Hh）-PTCh1-SMO轴的下游关键分子,而且还可以与其它非经典的PI3K/AKT、TNF-αmTOR、MAPK/ERk1/2等通路发生串连。我们发现,加入Hedgehog途径抑制剂处理后,胃癌腹腔脱落MCAs的相关干性标记物表达略有下降,而用GLI1的抑制剂或ERK1/2的抑制剂处理后,这些干性标记物的表达却显着降低。这些结果提示胃癌MCAs的干细胞样表型可能是通过ERK1/2途径活化GLI1来调节的。具体的调控途径还有待进一步研究。Integrin是由α、β亚单位形成的异源二聚体。Integrins在不同组织中的分布和功能不同,β3亚基主要介导肿瘤细胞的聚集和活力。我们发现,Integrinαvβ3介导胃癌脱落的癌细胞在腹腔中黏附聚集形成胃癌MCAs。另外,研究表明GLI1通常作为Integrin信号通路的下游调节分子而发挥作用。二、目的1、证实胃癌MCAs中存在活化GLI1的非经典途径Integrinαvβ3/ERK1/2。2、揭示Integrinαvβ3/ERK1/2活化GLI1在胃癌MCAs干细胞样表型调节中的作用及机制。三、材料与方法1、收集胃癌术后发生腹腔转移患者的腹水/腹腔冲洗液标本中的MCAs,从自我更新、增殖、耐药性、相关肿瘤干细胞标志物的表达、致瘤性等方面,鉴定胃癌腹腔脱落MCAs的干细胞样生物学功能。2、建立胃癌SGC7901 MCAs、BGC823 MCAs,利用Integrinαvβ3抑制剂Cilengitide、Integrinαvβ3刺激配体RGD、ERK抑制剂PD-184161、Hedgehog/Smoothened通路抑制剂Cyclopamine,同时构建慢病毒沉默Integrinβ3、Smo,构建含有GLI1启动子的荧光素酶报告基因,分别设置相关实验组,证实胃癌MCAs中存在活化GLI1的非经典途径Integrinαvβ3/ERK1/2。3、设置Integrinαvβ3抑制剂组、ERK抑制剂组、GLI1抑制剂组,分别检测各实验组的干细胞样特性,包括自我更新能力、增殖能力、相关肿瘤干细胞标志物的表达、致瘤能力;探讨是否Integrinαvβ3/ERK1/2/GLI1通路参与维持胃癌MCAs的干细胞样表型。4、构建GLI1慢病毒沉默组、GLI1过表达组,分别进行干细胞样特性的检测,包括自我更新能力、增殖能力、相关肿瘤干细胞标志物的表达和致瘤能力;验证GLI1是Integrinαvβ3/ERK1/2/GLI1途径调节胃癌MACs干细胞样生物学特性的关键分子。5、分别设置shIntegrinβ3#1组、shGLI1#1组、GLI1过表达组,构建不同实验组的裸鼠胃癌腹腔转移模型,进一步体内验证非经典途径Integrinαvβ3/ERK1/2/GLI1在胃癌腹腔转移中的作用。四、研究结果:1、与散在游离的癌细胞相比,胃癌腹腔脱落MCAs的集落形成能力增强、相关肿瘤干细胞标志物CD44,ALDH1A1,Oct4,Bmi1和Nanog的表达上调、无血清悬浮培养形成肿瘤球的数量增多、对临床一线化疗药物5-氟尿嘧啶和奥沙利铂的耐药能力增强、裸鼠致瘤能力增强。2、胃癌MCAs中,Integrinαvβ3调节GLI1的表达,并且是通过ERK1/2途径。经典的Hedgehog-GLI信号通路在其中几乎不起作用。3、分别抑制Integrinαvβ3、ERK1/2、GLI1后,各实验组胃癌MCAs的干细胞样生物学特性检测结果均显著降低;尤其在GLI1抑制剂组,胃癌MCAs的干细胞样特性下降最为明显。4、与空白对照组相比,shGLI1#1组的干细胞样生物学特性显着降低;相反,干细胞样生物学特性的各种表现在GLI1过表达组却显着增强。5、shIntegrinβ3#1组、shGLI1#1组的裸鼠腹腔移植瘤数量明显减少,而GLI1过表达组的腹腔移植瘤数量明显增多。五、结论:1、胃癌腹腔脱落MCAs在自我更新能力、增殖能力、耐药性、相关肿瘤干细胞标志物的表达、致瘤能力方面比散在游离的癌细胞明显增强,表现出干细胞样的生物学特性。2、胃癌MCAs中,存在活化GLI1的非经典途径Integrinαvβ3/ERK1/2;虽然与经典的Hedgehog-GLI信号通路存在串联,但GLI1主要是通过非经典的Integrinαvβ3/ERK1/2途径活化。3、Integrinαvβ3/ERK1/2/GLI1通路参与维持胃癌MCAs的干细胞样表型;抑制Integrinαvβ3/ERK1/2/GLI1途径中任何一个分子,均可下调胃癌MCAs的干细胞样特性。4、GLI1是Integrinαvβ3/ERK1/2/GLI1途径调节胃癌MACs干细胞样生物学特性的关键分子。5、体内实验进一步证实了Integrinαvβ3/ERK1/2/GLI1通路在胃癌腹腔转移中的潜在作用。