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Dystrophin(抗肌萎缩蛋白)基因位于人染色体Xp21.1-21.3,Dystrophin Dp71是由Dystrophin基因从位于62号外显子和63号外显子中的启动子区始动基因的转录、翻译的整个蛋白。翻译的整个Dp71蛋白保留了dystrophin蛋白的富含半胱氨酸区域和羧基端区域,在dystrophin基因编码的多种蛋白之中Dp71蛋白是在非肌肉组织内分布最广的一种。关于Dp71的研究表明,在胚胎发育的多能干细胞中可以检测到Dp71的表达。Dp71除了分布在细胞膜外,还在细胞核和细胞浆内有一定量的表达。3’端的剪切主要产生Dp71f和Dp71d两种剪切本。Dp71d剪切本主要分布在细胞核,Dp71f剪切本主要以细胞浆分布为主。相关的功能学研究表明,这两种不同的剪切本在PC12细胞的生长过程中起着同等重要的作用。通过和核纤层蛋白lamin B、核膜蛋白emerin结合,Dp71可以参与PC12细胞分裂的过程。Dp71还参与PC12细胞的细胞黏附等生物学行为。目前大部分关于Dp71的研究局限于PC12细胞,在其他细胞中生物学功能尚未开展任何研究。本课题选择正常人支气管上皮细胞HBE、建立Dp71过表达细胞模型,研究其生物学功能；选择人肺腺癌细胞系A549、建立Dp71过表达与表达抑制细胞模型；从在体裸鼠移植模型与离体细胞模型两方面进行Dp71相关生物学功能研究,以期为进一步研究Dp71的生物学功能提供实验依据。第一章过表达Dp71蛋白对于人正常支气管上皮细胞HBE的生物学特性的影响目的：建立稳定转染Dp71f和Dp71d真核表达质粒和其对应空白质粒的HBE细胞株；从增殖、浸润,迁移能力方面探讨其生物学特性,检测过表达Dp71蛋白对HBE生物学特性的影响；筛选可能的靶标分子。方法：采用G418筛选稳定转染了Dp71f和Dp71d真核表达质粒的HBE细胞株。运用CCK8,克隆形成实验检测5组HBE细胞的生长情况；Transwell细胞体外侵袭实验检测5组HBE细胞的侵袭能力；划痕实验检测5组HBE细胞的迁移能力；流式细胞术检测5组HBE细胞的细胞周期；Western blot检测5组HBE细胞中靶点蛋白的表达情况。结果：成功构建了稳定转染Dp71f和Dp71d真核表达质粒和其对应空白质粒的HBE细胞株。5组用于实验的细胞株分别为(HBE-Dp71f, Control-Dp71f, HBE-Dp71d, Control-Dp71d,空白HBE细胞株)。稳定转染了Dp71d真核表达质粒的细胞株HBE-Dp71d口空白HBE及Control-Dp71d细胞株相比；稳定转染了Dp71f真核表达质粒的细胞株HBE-Dp71f和空白HBE及Control-Dp71f细胞株相比,HBE-Dp71d和HBE-Dp71f细胞株表现为增殖加快、浸润及侵袭能力加强、迁移能力加快、细胞周期表现为GO+G1期缩短,差异具有统计学意义。Western blot及q-RT-PCR检测到,HBE-Dp71d和HBE-Dp71f细胞株中的laminB1和Bcl2的mRNA和蛋白的表达量增加。结论：和空白HBE及转染了对应空白对照质粒的HBE细胞株相比,HBE-Dp71d和HBE-Dp71f细胞株表现增殖加快、浸润及侵袭能力加强、迁移加快、细胞周期表现为GO+G1期缩短,这极有可能与HBE-Dp71d和HIBE-Dp71f细胞株中增高的laminB1和Bcl2相关。第二章过表达Dp71蛋白对于人肺腺癌细胞A549的生物学特性的影响目的：建立稳定转染Dp71f和Dp71d真核表达质粒和其对应空白质粒的A549细胞株；从增殖、浸润,迁移能力方面探讨其生物学特性,检测过表达Dp71蛋白对A549生物学特性的影响。方法：采用G418筛选稳定转染了Dp71f和Dp71d真核表达质粒的A549细胞株,运用CCK8,克隆形成实验检测5组A549细胞的增殖及克隆形成能力；Transwell细胞体外侵袭实验检测5组A549细胞的侵袭能力；划痕实验检测5组A549细胞的迁移能力。结果：成功构建稳定转染Dp71f和Dp71d真核表达质粒和其对应空白质粒的A549细胞株,5组用于实验的细胞株分别为(A549-Dp71f,Control-Dp71f, A549-Dp71d, Control-Dp71d,空白A549细胞株)。稳定转染了Dp71d真核表达质粒的细胞株A549-Dp71d和空白A549及Control-Dp71d细胞株相比；稳定转染了Dp71f真核表达质粒的细胞株A549-Dp71f和空白A549及Control-Dp71f细胞株相比,A549-Dp71d和A549-Dp71f细胞株表现为增殖加快、浸润及侵袭能力加强、迁移能力加快,差异具有统计学意义。结论：和空白A549及转染了对应空白对照质粒的A549细胞株相比,A549-Dp71d和A549-Dp71f细胞株表现增殖加快,浸润及侵袭能力加强,迁移加快。第三章RNA干扰抑制Dp71表达对于A549细胞系的生物学特性的影响目的：建立沉默Dp71表达的RNA干扰质粒,建立稳定转染Dp71干扰质粒的A549细胞株,分析其增殖、侵袭及迁移等生物学功能。方法：运用在线软件设计沉默Dp71基因表达的位点,构建Dp71的shRNA质粒；采用G418筛选稳定转染了Dp71的RNA干扰质粒的A549细胞株,运用CCK8,克隆形成实验检测3组A549细胞的生长情况；Transwell细胞体外侵袭实验检测3组A549细胞的侵袭能力；划痕实验检测3组A549细胞的迁移能力。结果：成功构建沉默Dp71基因表达的RNA干扰质粒,筛选了一个消减效率最高的质粒(2号质粒)。成功构建稳定转染2号干扰质粒的A549细胞株。3组用于实验的细胞株分别为(A549-Dp71AS, A549-Dp71-E,空白A549细胞株)。和空白A549及对照细胞株A549-Dp71-E相比,稳定转染了Dp71的RNA干扰质粒的细胞株A549-Dp71AS细胞株表现为增殖减慢、浸润及侵袭能力减弱、迁移能力减弱,差异具有统计学意义。结论：和空白A549及转染了对应空白对照质粒的A549细胞株相比,稳定转染了Dp71的RNA干扰质粒的A549-Dp71AS细胞株表现为增殖减慢、浸润及侵袭能力减弱、迁移能力减弱。第四章RNAi沉默Dp71基因对人A549细胞裸鼠移植瘤实验研究目的：建立人肺腺癌细胞A549的裸鼠皮下移植瘤模型,验证Dp71蛋白的消减在活体内(In vivo)是否同样具有抑制肿瘤生长的作用。方法：采用将处于对数生长期的各实验组成瘤细胞胰酶消化后,完全培养基重悬成细胞悬液,按照1-2×107个细胞/ml细胞悬液注射到裸鼠右侧腋窝,观察成瘤大小,测量生长曲线。结果：与注射了空白A549细胞及稳定转染了对照shRNA质粒的A549细胞的两组裸鼠相比,注射了稳定转染Dp71干扰质粒的A549细胞后的裸鼠移植瘤的成瘤潜伏期显著延长,生长速度明显减慢、瘤体体积显著减小,差异具有统计学意义。结论：裸鼠成瘤从在体实验水平证实了沉默A549细胞Dp71基因可以明显抑制A549皮下移植瘤的生长,证实消减Dp71的蛋白表达可以抑制A549的癌细胞特性。