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转Bt基因棉花已在全世界范围内得到广泛种植。有关Bt棉花生物安全性的研究,主要集中在土壤中Bt蛋白的来源和动态变化、Bt蛋白对土壤生态系统的影响、Bt棉田昆虫种群变化和环境安全等方面。对于Bt蛋白在土壤中降解、代谢、转移以及代谢产物对土壤微生物和非转基因作物的影响方面研究较少。本课题用土壤链霉菌所分泌的蛋白酶研究了 BtCry1Ac的代谢、鉴定了 BtCry1Ac蛋白降解的大分子片段和小分子多肽并研究了代谢产物在土壤中的转移及对所转移的作物和土壤微生物的影响。(1)合成BtCry1Ac基因,构建到质粒pGEX-4T-1中。该重组质粒BtCry1Ac-pGEX-4T-1转化到大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导原核表达融合蛋白。利用谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析纯化蛋白,纯化的Bt蛋白用已有的Bt Cry1Ac ELISA试剂盒进行了验证。(2)研究了利用免疫亲和层析法(IAC)从转Bt棉中纯化Bt蛋白的方法。活化凝胶结合抗体蛋白率0.0262 mg/mg,是商品化凝胶结合率的40.6%。棉籽提取液中90%Bt蛋白被凝胶亲和吸附,仅约1%能被洗脱,且杂质较多。(3)用液质联用、Edman降解法鉴定了 BtCry1Ac蛋白的代谢产物。6种稳定存在的小分子多肽:NDMNSALTT、TNPVLEN、GNAAPQQR、SNTVPATATSLDN、ATSLDNLQSSD、SLDNLQSSD;两种大分子片段:条带1的N端第30氨基酸起,C端范围360～373、条带2的N端第374氨基酸起,C端范围602～648。(4)利用125I标记多肽(125I-YTNPVLEN),添加到小麦、西瓜根际土壤中。1小时内,西瓜茎、叶和小麦茎、叶中放射性最大值分别是3038.2×10-5μCi/g、287.9×10-5μCi/g和3999.6×10-5μCi/g、1006.7×10-5μCi/g,是对照组对应茎、叶的 120 倍、14.6 倍和 19.5 倍、8.4 倍。(5)从大田土壤分离固氮菌、解钾细菌和解有机磷细菌,分别向培养基中添加3种鉴定的代谢片段,结果证明多肽对它们的生长无显著影响;将3种多肽溶液喷施于小麦、西瓜和玉米叶片,再测定三种作物的生理指标(可溶性蛋白、可溶性糖、叶绿素和SOD),同样发现它们的生理指标无显著差异。6-苄基腺嘌呤(6-BA)是一种人工合成的细胞分裂素(CTK)类植物生长调节剂,常被违法用于豆芽生产。本论文对6-BA残留的快速检测方法也进行了研究。(1)利用高碘酸氧化法将6-苄基腺嘌呤核苷与蛋白质偶联,制备了完全抗原,免疫Balb/c小鼠。通过脾细胞与骨髓瘤融合,筛选到专一识别6-BA的单克隆细胞(mAb3E5)。通过体内诱生法获取大量腹水,饱和硫酸铵沉淀法纯化单抗,mAb 3E5抗体性质鉴定结果为IgG1亚类,1κ型轻链。(2)建立了 icELISA方法,它的IC50为18.9ng/mL,检测范围是3.6～106ng/mL。在空白豆芽中添加6-BA,icELISA的回收率为75.7～88.9%,液质联用(LC-ESI-MS)的回收率为104.1～109.1%,两种方法的相关系数0.997。单抗3E5与6-BAR、KT、IP、IPR的交叉反应率分别为315%、5.6%、1.2%、3.4%,与 Z、ZR、DHZR 没有交叉反应。