论文部分内容阅读
结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是最常见的消化道恶性肿瘤之一,也是全球癌症死亡的第三大原因。近年来,通过对结肠癌采取手术、化疗、放疗和生物治疗等综合治疗策略,结肠癌的发病率和死亡率有了持续性下降,但是,结肠癌的发病率在发展中国家却呈现上升趋势。结肠癌的发生发展过程受多种因素的影响,是一个多基因相关、多步骤的复杂过程。因此,急需探究结肠癌发病相关的分子机制以及筛选更有效的靶向结肠癌的治疗药物。目前,miRNA及其靶基因常被作为肿瘤治疗的生物标志物或治疗靶标而备受关注,已成为较有前景的肿瘤预测指标。miRNA是18-25 nt的内源性小非编码RNA家族,通过结合靶向m RNA的3′-UTR区,负调控基因的转录后水平。大量的研究数据已经表明miRNA参与细胞内多种生物学过程,包括细胞的增殖、分化、周期、迁移、侵袭和凋亡等。在肿瘤细胞中,根据靶向调控的基因不同,miRNA可以作为致癌因子或抑癌因子发挥功能。本论文通过检测和分析原发性结肠癌组织中miR-372-3p的表达水平及其与临床指标和肿瘤病理检测指标之间的相关性,发现miR-372-3p与MAP3K2之间呈现负相关,并在结肠癌SW480细胞中阐明了miR-372-3p能够靶向调控MAP3K2的表达水平,进而抑制结肠癌细胞增殖,而且miR-372-3p/MAP3K2可能参与调控MAP3K2-MEK5-ERK5信号传导途径。以下为本论文的主要工作与结果:1.本研究收集了153例冷冻组织样本,包括原发性结肠癌组织和相匹配的正常结肠或肿瘤邻近组织,并利用RT-q PCR技术,对miR-372-3p的表达水平进行了检测和评估。统计学分析结果显示,与正常组织相比较,癌组织中的miR-372-3p表达量显著降低。同时,肿瘤邻近组织中的miR-372-3p表达量也呈现明显的下降趋势,提示miR-372-3p表达量在结肠癌发生早期就开始出现下降,有可能成为结肠癌早期诊断的预测指标。另外,癌组织中miR-372-3p的低表达与临床病理分期和淋巴结转移密切相关;2.对来自所有原发性结肠癌患者的组织样本进行了病理组织切片,并利用免疫组织化学染色法检测了与结肠癌发病密切相关蛋白,包括MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、p53、Ki67和HRE-2。相关性统计分析发现,低表达miR-372-3p的结肠癌组织中增殖细胞的相关抗原Ki67的表达量明显增多,提示miR-372-3p的表达水平可能参与调控结肠癌细胞的增殖过程;3.利用db DEMC和UALCAN网站预测和筛选了miR-372-3p的候选靶基因,并结合已发表的文献,最终选择并探讨了HDAC4、p21、Wee1和MAP3K2四个基因在结肠癌中的表达水平。检测结果显示,除了p21以外,HDAC4、Wee1和MAP3K2在结肠癌组织中的表达水平与相匹配的正常组织比较具有显著性差异,其中Wee1的表达水平明显降低,而HDAC4和MAP3K2呈现高表达。相关性统计分析结果发现miR-372-3p的低表达和MAP3K2间存在负相关性,提示miR-372-3p和MAP3K2间可能具有调控关系;4.为了验证上述检测和分析结果,首先利用pm R-m Cherry载体构建了能够在哺乳动物细胞中表达miR-372-3p的质粒,并在结肠癌细胞SW480中通过MTT、CCK-8和集落形成实验证实了miR-372-3p可以抑制结肠癌细胞的生存活力和集落形成能力,验证了我们在组织样本中分析的miR-372-3p影响结肠癌细胞增殖的推测。同时发现过表达miR-372-3p可以抑制MAP3K2的m RNA和蛋白表达水平,提示miR-372-3p可能靶向调控MAP3K2的表达水平;5.进一步,通过UALCAN网站预测并发现在MAP3K2-3′-UTR区域中有两个miR-372-3p结合的靶序列,并利用p MIR-REPORT-Luc载体构建了含有这两个靶序列的MAP3K2-3′-UTR荧光素酶报告基因质粒（包括靶序列突变体）,然后在SW480结肠癌细胞中检测了miR-372-3p对双荧光素酶活性的影响。如所预期,miR-372-3p抑制p MIR-MAP3K2-3’-UTR荧光素酶活性,而这一作用因突变miR-372-3p的结合位点而消失,证实miR-372-3p通过与MAP3K2-3′-UTR区域中的靶序列结合,进而转录后调控MAP3K2的表达水平以及其细胞内的功能。最后,我们发现miR-372-3p对MAP3K2表达的调控直接影响下游靶点MAP2K5（MER5）的表达水平,提示miR-372-3p/MAP3K2可能参与调控MAP3K2-MEK5-ERK5信号途径。综上所述,本论文以原发性结肠癌组织样本和结肠癌SW480细胞系作为研究对象,明确了miR-372-3p在结肠癌组织中显著低表达,而miR-372-3p的低表达与组织中Ki67和MAP3K2的表达水平密切相关。并利用细胞实验阐明miR-372-3p通过直接与MAP3K2-3′-UTR区域中的靶序列结合,负调控MAP3K2的表达和生物功能。本研究为后续结肠癌早期基因诊断和靶向药物治疗的研发提供了新的思路。