目的:目前对结核分枝杆菌(Bacillus Tuberculosis,TB)的检测,主要靠X线、涂片、培养加药敏、PCR技术等多项传统试验综合分析,方法繁杂、耗时长,敏感度低和特异性差,易导致误诊和漏诊,病人经济负担重。治疗结核的药物种类多、作用原理复杂、长期滥用、临床用药不规范等,造成结核分枝杆菌的耐药基因突变日益复杂,其突变位点范围广,突变形式复杂,从单碱基突变、缺失、插入、错位到多位点、长片段突变等,为准确、全面检测其耐药突变基因造成极大困难,特别是对广泛存在的单碱基突变位点检测,使用传统方法包括传统基因芯片有较大技术难度。其多重耐药问题一直是影响其治疗、传播的主要原因,传统检测方法指标单一,提供的耐药信息量少,因此建立快速、敏感、全面、简便的结核杆菌鉴定及多重耐药检测系统是目前国内外实验诊断学急需解决的问题,也是有效治疗和控制该类致病菌的有效手段。分子信标探针是一种具有很高单碱基突变位点检测能力的核酸探针,但受结构限制,分子信标探针在荧光芯片领域的实际运用目前尚处于空白状态。本研究拟充分利用分子信标探针与靶分子单碱基突变位点检测特异性更强的特性和芯片高通量特点结合,研制构建一种结核杆菌耐药基因多重突变位点分子信标(MB)探针芯片检测技术,可直接对结核杆菌核酸及耐药基因多重靶点进行特异检测,为结核分枝杆菌及耐药基因鉴定、流行病学调查提供新的技术手段。方法:1.根据GenBank找到结核分枝杆菌IS986基因序列,在Primer Premier V5.0软件上设计引物。对反应体系中MgCl2、引物、dNTP浓度以及引物退火温度优化后建立结核杆菌PCR反应扩增体系。通过测序、灵敏性试验以及特异性试验对体系进行综合评估。用beacon designer 2.1软件设计结核分枝杆菌通用分子信标探针。通过对杂交温度、杂交时间以及杂交方式的优化,建立PCR反应中及反应后加入TB分子信标杂交试验。运用凝胶成像分析仪、荧光分光光度计、荧光显微镜等各种途径对MB-PCR杂交产物荧光信号的观测条件进行摸索。进行不同荧光-淬灭分子对标记分子信标的观测。2.通过带单侧延长臂分子信标连接方式和传统生物素(biotin)-亲和素(avidin)连接方式的研究对TB分子信标与芯片固定和杂交方式进行探索。提高分子信标芯片杂交效率优化实验包括:5/寡核苷酸探针浓度;分子信标探针浓度;杂交温度、杂交时间、杂交液配方;点样大小与点样浓度;阴-阳性区分的临界值等。通用TB-MB芯片的临床应用和方法学比较。3.NCBI数据库查找4种结核杆菌耐药基因主要突变区域(多重位点)。针对以上位点设计扩增体系进行扩增体系优化。针对以上位点设计TB分子信标探针及相应单侧延长臂分子信标探针。进行TB耐药突变位点单侧延长臂分子信标探针芯片表面杂交系列实验:杂交温度梯度实验(选择45℃、50℃、55℃、60℃、65℃作杂交温度)。杂交时间梯度实验(分2、4、6、8、10、12、14、16、18h不等时间段杂交)。靶序列浓度梯度杂交实验(分0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09uM等不同浓度杂交)。荧光显微镜的观测。4.针对以上位点进行的相应TB临床耐药分离株PCR扩增。各位点TB临床耐药分离株PCR扩增产物测序。在已摸索出的最佳条件下运用多重MB探针芯片对各位点TB临床耐药分离株PCR产物进行杂交反应并与测序结果对照。主要结果:1.优化后的通用TB-PCR反应体系MgCl2、引物以及dNTP最佳终浓度分别为: 4mmol/l、0.04μmol/l以及0.2 mmol/l;退火温度为55℃。测序结果与GenBank中公布的序列完全一致。体系对其它细菌无交叉反应。检测限度为1拷贝。水浴、PCR仪、恒温摇床的最适杂交温度和适杂时间分别为:55℃,16h;65℃,4h;50℃,7h。荧光显微镜观测MB-PCR杂交阳性产物、MB-PCR杂交阴性产物荧光强度差异明显(p<0.01)。分子信标荧光-淬灭效率较高的有:Cy3-BDH、FAM-DABCLYE;较差的有:Cy3-DABCLYE、FAM–BDH。2.分子信标茎臂生物素-亲和素(biotin-avidin)修饰有相当技术难度。单侧延长臂分子信标采用淬灭分子中间标记,茎结构单侧(淬灭分子一侧)延长臂,能很好的结合在芯片上,且修饰技术难度低、特异性好。oligo探针最适浓度为40μmol/L。三种杂交液的杂交结果比较:0.15%SDS效果好于0.2%SDS,10×SSC效果好于5×SSC。Cy3-BDH探针浓度约15μmol/L、FAM-DABCLYE探针浓度约9μmol/L时杂交反应达到7h以上可检测到较强信号。随着点样直径的缩小,同浓度样本荧光强度不变;随着浓度的倍比减小,点样荧光强度也减小;对较理想区分阴阳性的信号强度:Cy3-BDH浓度约10μmol/L,FAM-DABCLYE浓度约15μmol/L。TB-MB芯片对临床标本总检出率为57.5%(23/40),高于涂片27.5%(11/40)和培养35%(14/40),经统计学处理TB-MB芯片与涂片、培养相比差异有显著性(分别为χ2=7.366,P<0.01;χ2=32.281 , P<0.01)。3.准确定位4种结核杆菌耐药主要突变基因区域:耐链霉素:rpsl(43、88)、rrs;耐异烟肼:katG(315、463);耐乙胺丁醇:embB(285、303、306、330);耐利福平:ropB突变核心区域、扩充的突变区域。针对以上位点设计了扩增体系并成功优化了扩增体系,均顺利扩增出特异性目的片段。针对以上位点成功设计出分子信标探针及相应单侧延长臂分子信标探针。完成了各位点分子信标探针芯片表面杂交系列实验。按rpsl43、rpsl88、rrs、katG315、katG463、embB285、embB303、embB306、embB 330、ropB-MB1-1、ropB-MB1-2、ropB-MB1-3、ropB-MB1-4、ropB-MB2-1、ropB-MB2-2顺序,各位点最佳杂交条件分别是:(杂交温度梯度实验:50℃、50℃、50℃、55℃、65℃、55℃、55℃、45℃、60℃、60℃、50℃、65℃、60℃、55℃、55℃;杂交时间梯度实验:12、14、14、16、12、12、8、14、10、10、10、8、12、10、8h;靶序列浓度梯度杂交实验:0.06、0.05、0.06、0.04、0.05、0.04、0.07、0.05、0.05、0.05、0.06、0.04、0.05、0.04、0.04uM)。荧光显微镜的观测各位点荧光信号阳-阴性区别明显。4.4种TB耐药主要突变基因区域进行的相应临床耐药分离株PCR均顺利扩增。扩增产物测序:耐链霉素rpsL基因43位密码子突变率65%,密码子88为60%,且75%与43codon突变株重叠。Rrs突变率为15%,耐SM突变率多位点重复率较高。耐异烟肼KatG315codon突变率为50%,463位点突变率为37%。耐乙胺丁醇子密码子285密码子突变率为15%;303密码子突变率为6%;306密码子突变率为70%;330密码子突变率为3%;12%未找到突变点,306密码子突变率最多。耐利福平rpoB全部找到该区段内的突变位点且较复杂,多位点同时突变较多。成功运用多重MB探针芯片对各位点TB临床耐药分离株PCR产物进行杂交反应,与测序结果对比有较好的一致性。结论:1、本研究采用多重分子信标探针成功实现了对4种结核杆菌耐药基因主要突变区域多重靶点的检测。研究摸索了对单碱基靶点突变具高灵敏及特异检测能力的分子信标探针设计模型及其杂交检测技术。2、设计合成了结核杆菌通用高特异性MB探针,并进行了扩增中/扩增后加入通用MB探针系列实验。通过凝胶成像分析仪、荧光分光光度计、荧光显微镜等各种途径对通用MB探针杂交荧光观测条件进行了摸索,为荧光芯片运用作了技术储备。通过与传统方法临床标本进行结核杆菌检测,证实了通用TB-MB探针荧光芯片具有较高的阳性检出率、灵敏性、特异性。3、单侧延长臂分子信标探针的设计发明对解决分子信标探针在芯片表面的固定难题提供了一种简单思路。对解决传统MB探针茎臂修蚀技术难,杂交无特异性、在多分子检测的中高密度芯片领域难以实际应用等难点具积极意义。4、建立了针对4种结核杆菌耐药基因各突变位点的PCR扩增体系,设计、合成、筛选了相应的多重TB分子信标探针及其单侧延长臂分子信标探针,并完成进行MB探针芯片杂交优化系列实验和条件优化。5、成功运用多重MB探针芯片检测各位点TB临床耐药分离株PCR产物的杂交反应。并与测序对照有较好的一致性。说明对分子信标探针对单碱基突变具较高的灵敏和特异检测能力,引入于基因芯片领域,实现了对多靶点碱基突变联检的目标。