阿尔茨海默病(AD)是一种发生于老年期或老年前期的慢性进行性神经退行性疾病，AD的发病机制目前尚未完全阐明，但自由基损伤学说和细胞凋亡学说备受人们的关注，其特征性的病理变化之一是脑内神经元数目明显减少，尤其是基底前脑和海马区受累最严重，神经元减少平均达47％。　　 目前认为，细胞凋亡可能是引起神经元减少的重要原因，与年龄相匹配的非AD老年人相比，AD脑的易损区细胞凋亡明显增加，可见DNA断裂损伤，凋亡小体及染色质凝集等。　　 β-蜕皮甾酮(20-Hydroxyecdysone)是从露水草等提取出的一类植物甾酮，主要用于改善脑缺血症状、改善脑血管痉挛，改善脑功能。对高等动物表现出较强的药理活性，具有改善微循环、抗氧化及细胞保护、降低毛细血管通透性、影响免疫系统及中枢神经系统等等多种功效。现有研究表明β-蜕皮甾酮对缺氧、炎症等多种因素下细胞的分化、增殖、凋亡、分泌具有调节作用。已经有实验报道β-蜕皮甾酮对AD有治疗作用，但其具体机制还不清楚。　　 然而β-蜕皮甾酮是否能通过抑制神经细胞凋亡治疗AD，以及它的作用机制尚未见文献报到。在本实验中我们首先用APP/PS-1转基因AD模型小鼠验证β-蜕皮甾酮抑制神经细胞凋亡及改善小鼠学习记忆能力的作用。然后在PC-12细胞系中构建β-淀粉样多肽(Aβ)引起细胞凋亡的模型，研究β-蜕皮甾酮对β-淀粉样多肽(Aβ)引起细胞凋亡的抑制作用及其机制。　　 材料与方法：　　 1、实验动物　　 APP/PS-1转基因小鼠12只，雌雄各半，9月龄（22±2）g，由中国医科大学实验动物中心提供。　　 2、行为学检测（水迷宫）　　 A.定位航行实验B.空间探索实验3、细胞培养PC-12细胞使用DMEM培养基含10％的灭活小牛血清，以及100IU/ml青霉素，和100μg/ml链霉素。　　 4、Real-time PCR(SYBR Green method)细胞采用RNeasy plus Mini kit提取总RNA，使用SYBR Green PCR master mix进行定量real-time PCR扩增，总体积20μl。使用7900HT实时定量PCR仪。　　 5、Western blot法检测蛋白表达细胞蛋白量为60ug，12％SDS-PAGE凝胶电泳、转印到PVDF上，5％BSA室温封闭2h，4℃孵育过夜。分别与对应的二抗(1∶2000)室温孵育2h，ECL显色。　　 6、细胞增殖能力实验使用Cell Counting Kit-8(R) solution检测细胞的增殖能力。　　 7、Caspase-3活性检测Caspase-3活性检测用Caspase-3活性检测试剂盒。　　 8、细胞凋亡能力检测使用Annexin V-FITC/PI双染试剂盒进行细胞凋亡检测。　　 9、免疫组织化学染色APP/PS1转基因小鼠冰冻切片室温自然晾干抗体4℃孵育过夜，DAB显色10min，蒸馏水冲洗终止反应，甲苯胺兰复染，常规脱水、透明、封片，光学显微镜下观察并采集图像和分析。　　 结果：　　 1、β-蜕皮甾酮对APP/PS1转基因鼠学习记忆能力的影响可视平台实验:提示β-蜕皮甾酮不影响小鼠的游泳能力及视力。隐蔽平台实验和空间探索实验中，β-蜕皮甾酮组小鼠经过相应平台位置的次数与模型组小鼠比明显增加，表明β-蜕皮甾酮改善了APP/PS-1转基因小鼠的学习记忆能力。　　 2、β-蜕皮甾酮能改善小鼠神经细胞受损状态免疫组化检测β-淀粉样多肽的含量观察两组小鼠大脑皮层中老年斑的含量，发现经β-蜕皮甾酮灌胃后，小鼠大脑皮层和海马区老年斑的含量明显减少，Bcl-2的水平显著升高，而Bax的水平则降低。同时小鼠脑组织TUNEL染色显示给药组小鼠脑组织细胞凋亡水平明显降低。以上实验结果均说明β-蜕皮甾酮促进AD小鼠学习记忆能力与抑制小鼠老年斑形成及抑制神经细胞凋亡有关。　　 3、PC-12细胞系中β-蜕皮甾酮降低了β-淀粉样多肽引起的细胞毒性作用β-淀粉样多肽对细胞的活性有显著的抑制作用，而且这种抑制作用是浓度依赖性的。如果在加入β-淀粉样多肽之前24小在细胞培养基中加入了200μM的β-蜕皮甾酮，则能显著逆转由β-淀粉样多肽引起的PC-12细胞活力下降。以上结果表明，β-蜕皮甾酮在PC-12细胞中能减少β-淀粉样多肽引起的细胞损伤。　　 4、在PC-12细胞中，β-蜕皮甾酮抑制了β-淀粉样多肽引起的细胞凋亡流式细胞仪的结果和Caspase-3的活性实验均证实，β-淀粉样多肽能显著增加PC-12细胞的凋亡百分比，而在加入β-淀粉样多肽之前24小时如果加入了β-蜕皮甾酮则能减少细胞的凋亡水平。说明β-蜕皮甾酮能抑制由β-淀粉样多肽引起的PC-12细胞凋亡。　　 5、在PC-12细胞中，β-蜕皮甾酮通过提高Bcl-2的水平抑制细胞凋亡加入β-淀粉样多肽能抑制Bcl-2的表达，同时升高促进凋亡蛋白Bax及Caspase-3的表达;如果加入β-淀粉样多肽之前加入了β-蜕皮甾酮，则能逆转这种变化。Bcl-2和Bax蛋白水平的变化和其mRNA水平的变化趋势是一致的。因此，β-蜕皮甾酮抑制细胞凋亡是通过升高Bcl-2，降低Bax的水平来实现的。6、β-蜕皮甾酮通过促进AKT的磷酸化激活上调bcl-2，抑制神经细胞凋亡加入β-蜕皮甾酮前1小时加入了AKT特异性抑制剂LY294002，然后再检测PC-12细胞活性及凋亡情况。AKT抑制剂能降低β-蜕皮甾酮的凋亡抑制作用和细胞活性保护作用，这说明β-蜕皮甾酮发挥它的功能需要AKT的参与。　　 P-AKT及Bcl-2的表达相关性结果发现:在细胞系中Aβ能同时减少P-AKT及Bcl-2的表达水平，而加入β-蜕皮甾酮则能同时上调这两种蛋白的表达。如果在加入β-蜕皮甾酮的之前加入了AKT抑制剂LY294002，不仅P-AKT的水平受到抑制，Bcl-2的蛋白水平也明显将低了。综上所述，β-蜕皮甾酮是通过促进AKT的磷酸化上调Bcl-2的表达，抑制Aβ诱导的PC-12细胞凋亡。　　 讨论：　　 细胞凋亡可能是引起神经元减少的重要原因，在本实验中我们使用了APP/PS-1 AD模型小鼠和PC-12细胞中加入Aβ，模拟脑损伤的病理学进程用于验证β-蜕皮甾酮这种天然药物对神经细胞的保护作用。　　 水迷宫实验结果显示，隐蔽平台试验和定向航行中，实验组逃避潜伏期时间均明显短于模型组(P＜0.05);同时免疫组化显示β-蜕皮甾酮能减少小鼠脑组织中老年斑的含量及细胞凋亡的水平，说明β-蜕皮甾酮具有改善AD小鼠学习记忆的作用，这种作用与抑制神经细胞凋亡有关。　　 在细胞模型的研究中我们发现β-蜕皮甾酮可以减少由Aβ引起的PC-12细胞损伤。β-蜕皮甾酮对PC-12细胞的保护作用通过CCK-8分析及流式细胞仪分选得到证实。　　 Bcl-2家族成员对细胞凋亡的调控起着非常重要的作用。在本研究中我们发现Aβ能引起PC-12细胞中Bcl-2的水平显著降低，而Bax的水平显著增高，Bcl-2/Bax的比率的降低，使更多的细胞发生了凋亡。如果将PC-12细胞用β-蜕皮甾酮预处理，则这种变化的程度将减弱，说明β-蜕皮甾酮可以通过影响Bcl-2/ Bax的表达水平影响Aβ能引起PC-12细胞的凋亡。　　 β-蜕皮甾酮是如何引起Bax和Bcl-2的变化的呢？接下来，我们在使用β-蜕皮甾酮的同时使用了AKT通路的抑制剂LY294002，结果发现该抑制剂在抑制P-AKT的同时抑制了β-蜕皮甾酮的药效。在PC-12细胞中加入Aβ能同时减少P-AKT及Bcl-2的表达，而再加入β-蜕皮甾酮则能上调二者的表达。此外，我们在加入AKT通路的抑制剂LY294002的实验组检测Bcl-2的表达水平发现，LY294002能显著减少bcl-2的水平。因此我们认为β-蜕皮甾酮抑制神经细胞凋亡的过程中需要P-AKT的参与，β-蜕皮甾酮可以通过提高P-AKT的水平上调Bcl-2的表达，抑制由Aβ引起的PC-12细胞凋亡。　　 目前，许多在实验室验证有效的神经保护类药物在临床实验中效果不理想，因此开发新的有效的药物是目前亟需解决的问题。在本实验中β-蜕皮甾酮可以有效抑制由Aβ引起的PC-12细胞凋亡，它可以增加P-AKT、Bcl-2/Bax的水平，降低Caspase-3的活性。另外，β-蜕皮甾酮作为一种天然药物对其他哺乳动物副作用小，因此其保护作用值得进一步研究，具有一定的临床应用价值。　　 结论：　　 β-蜕皮甾酮通过上调P-AKT的水平促进Bcl-2的表达，抑制由β-淀粉样多肽引起的神经细胞的凋亡，起到保护神经细胞的作用。