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白桦脂酸(Betulinic acid,BetA)是一种五环三萜烯,存在于多种天然植物中。近年来发现白桦脂酸具有抗肿瘤、抗HIV、抗炎、抗菌、抗疟疾等多种生物活性,并且具有抗高胆固醇和肥胖等多种有益于人体健康的特殊功效。近年来发现白桦脂酸在抗肿瘤方面具有突出的表现,能够选择性诱导肿瘤细胞凋亡,并且不损伤正常细胞。因此白桦脂酸是一类很有潜力的无毒副作用的药物先导化合物。但由于哺乳动物细胞信号通路复杂交织,干扰因素较多,因此对于哺乳动物中白桦脂酸抗癌潜力的精确机制的研究仍是一项巨大挑战,白桦脂酸的直接分子目标还有待于确认。由于细胞凋亡过程的保守性,以及酵母作为分子生物学模式物种的先天优势,我们采用酵母这种模式生物代替复杂的哺乳动物细胞来探究白桦脂酸诱导细胞凋亡的机制。同时也为阐明白桦脂酸诱导哺乳动物癌细胞或肿瘤细胞凋亡的调节机制提供帮助。酿酒酵母液泡中Pep4p(也称为酵母蛋白酶A)是人类组织蛋白酶D的同源蛋白。Pep4p不仅在催化蛋白质水解及其他酶的转录加工中发挥作用,近年来人们发现其参与酵母细胞凋亡调控,与线粒体AAC (ADP/ATP载体)蛋白共同干预线粒体的降解。我们通过研究酵母中液泡蛋白酶与线粒体的相互作用,可能为哺乳动物类凋亡中线粒体与溶酶体介导的信号途径间的复杂交互作用提供新的认识。本学位论文主要以下几个方面开展研究：1、白桦脂酸对酵母细胞的毒性作用；2、白桦脂酸诱导酵母细胞死亡是否以凋亡的形式进行；3、白桦脂酸诱导细胞凋亡的机制；4、Pep4p在白桦脂酸诱导细胞凋亡过程中的作用。论文采用20ug/mL白桦脂酸作用于酵母细胞,通过细胞兰活力试剂盒检测酵母的细胞活力,通过平板实验检测酵母细胞的存活率。采用DAPI染色、Annexin V/PI染色和TUNEL染色法检测酵母细胞的凋亡,并借助透射电镜观察酵母细胞的内部结构。实验结果表明,随着白桦脂酸处理时间的增加,酵母细胞的细胞活力逐渐降低、死亡率随之增加,并且伴随着核碎片的产生、染色质收缩、磷脂酸丝氨酸外翻、DNA断裂等明显的凋亡表征。所以白桦脂酸引起的细胞死亡主要是以凋亡形式进行的。使用活化Caspase荧光染色试剂盒检测酵母细胞内caspase的活性。同时,采用dihydroethidium (DHE)及Rhodamine123分别检测酵母细胞内的ROS产生及线粒体膜电位的变化。以q-PCR法检测了酵母caspase-Ycal及Aif1、Ndi1、Cyc1、Cyc7、Fisl和Dnml这六种与线粒体相关的凋亡基因表达量的变化。结果发现,当白桦脂酸处理后,酵母细胞内ROS水平上升、线粒体膜电位瞬态超极化后去极化现象的发生,且六种凋亡基因的表达量也发生明显变化。但是酵母细胞内caspase未被激活。这意味着白桦脂酸诱导酵母细胞凋亡是通过线粒体途径实现的。此外,Pep4p的存在能够保护暴露于白桦脂酸处理的酵母细胞,减缓白桦脂酸对酵母细胞的损伤程度,但具体的作用机制仍有待于进一步研究。