第一篇乏氧及CD137通路对DC功能的影响目的乏氧是指局部组织器官处于一种远远低于大气氧压的极低氧压状态,主要见于许多生理及病理条件下,如远离毛细血管末端的组织,炎症或肿瘤组织,以及器官移植、低血容量性休克、肝脏手术、心血管疾病等缺血情况。乏氧可促进肿瘤细胞对放疗和化疗的抵抗,并可诱发其表型改变,从而促进其转移扩散,因此治疗后其预后往往较差。尽管乏氧对肿瘤细胞生物学特性和行为的影响已有大量研究报道,但是在肿瘤、炎症等乏氧微环境中,免疫细胞及免疫功能如何发生变化,尚不完全清楚。目前有限的研究主要集中于乏氧对巨噬细胞的影响,散在的体外实验显示乏氧可抑制T细胞功能,如细胞活化增殖明显减少,细胞因子表达显著降低等,但具体的内在机制并不清楚。树突状细胞(Dendritic cells,DC)作为连接固有免疫和适应性免疫应答的抗原递呈细胞,其成熟状态直接影响其抗原递呈功能及刺激T细胞增殖的能力。未成熟DC主要位于外周非免疫器官或组织,摄取抗原之后向引流淋巴结迁移并逐渐分化为成熟DC,成熟DC高表达MHC-Ⅱ类分子及协同刺激分子CD80、CD86等,具有很强的抗原递呈能力,从而诱导适应性免疫应答的产生。DC的归巢及迁徙往往需要经过炎症、肿瘤等病理组织,其中乏氧微环境对DC的状态和功能影响如何?目前尚不明确。已有研究显示乏氧条件下分化的人单核细胞来源的DC,其基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP9)的表达明显降低,迁移能力明显下降,但是乏氧对小鼠DC的成熟及功能的影响,则鲜有报到。此外,缺血部位血液的再灌注可导致乏氧组织氧压的迅速提升,而这种氧压的急剧变化对DC及其所介导的适应性免疫的影响如何?目前尚无研究涉及。因此,本课题在研究乏氧条件下小鼠骨髓来源DC(bone marrow derived-DC,BM-DC)表型及功能变化的基础上,进一步探索了再氧合对乏氧DC表型及功能的影响,这对于解释缺血再灌注损伤的发病机制,控制器官移植的排斥反应以及肿瘤免疫治疗等许多方面都具有重要的指导意义。CD137-CD137L是继CD28-B7之外的另一对重要的协同刺激分子。CD137属于肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor,TNFR)超家族,主要表达于活化的T细胞,是一种可诱导的T细胞膜表面受体。CD137-CD137L通路可依赖或不依赖CD28-B7途径提供协同刺激信号,导致CD4~+、CD8~+T细胞的活化、增殖及分化,在适应性免疫应答中,尤其是初次应答晚期以及再次应答中发挥着重要作用。近年研究显示CD137亦可表达于小鼠脾脏和骨髓来源的DC表面,刺激性抗CD137单抗可增强DC分泌IL-6和IL-12等细胞因子及其刺激T细胞增殖的能力,表明CD137通路在调节和增强DC功能方面具有不容忽视的作用。因此,本课题在研究乏氧、再氧合对小鼠DC功能影响的基础上,进一步探讨了CD137通路对乏氧DC功能的影响,以期通过CD137通路增强乏氧DC的功能,进而增强固有免疫应答或适应性免疫应答,从而为肿瘤以及移植排斥等的免疫治疗提供新的思路和方法。方法一、常、乏氧条件下DC的表型及功能变化1.分离C57BL/6小鼠骨髓细胞,分别在常、乏氧条件下利用GM-CSF和IL-4诱导未成熟DC,LPS刺激DC成熟。2.流式细胞术检测常、乏氧条件下分化DC表面的协同刺激分子CD80,CD86及MHC-Ⅱ类分子的表达差异。3.RT-PCR和ELISA法分别检测常、乏氧条件下分化DC所分泌细胞因子IL-1β,IL-6,TNF-α,TGF-β以及基质金属蛋白酶MMP9的表达差异。4.CFSE法检测常、乏氧条件下分化DC刺激CD4~+T细胞增殖能力的差异。二、再氧合对乏氧条件下DC表型及功能的影响1.对乏氧条件下分化的DC进行不同时间的再氧合。2.流式细胞术检测再氧合DC的表型变化(CD80,CD86及MHC-Ⅱ类分子)。3.CFSE方法检测再氧合DC刺激CD4~+T细胞增殖能力的变化。5.流式细胞术检测再氧合DC刺激CD4~+T细胞向IFN-γ~+Th1,IL-4~+Th2细胞的分化。5.ELISA方法检测再氧合DC刺激CD4~+T细胞增殖体系中细胞因子IFN-γ和IL-4的表达水平。三、CD137通路对乏氧条件下分化DC表型及功能的影响1.以抗CD137单克隆抗体刺激乏氧条件下分化的DC。2.流式细胞术检测抗CD137单抗刺激DC的表型变化(CD80,CD86及MHC-Ⅱ类分子)。3.RT-PCR法检测抗CD137单抗刺激DC所分泌细胞因子以及基质金属蛋白酶MMP9的表达变化。4.CFSE法检测抗CD137单抗刺激DC刺激CD4~+T细胞增殖能力的变化。结果一、乏氧对DC表型及功能的影响1.骨髓来源DC的诱导和纯度自C57BL/6小鼠分离骨髓细胞,在GM-CSF和IL-4存在的情况下,分别于常、乏氧条件下诱导分化未成熟DC,并于第6天用LPS刺激18-24小时,以诱导DC的成熟。形态学结果显示,无论在常、乏氧条件下,至诱导第5-7天,光镜下均可见具有典型树突状形态的DC。流式细胞术检测结果显示,所收获BM-DC表面CD11c的表达均在80%以上,达到所要求的DC纯度。提示乏氧条件并不影响DC的诱导分化。2.乏氧抑制DC的表型成熟为了研究乏氧微环境是否影响DC的表型成熟,我们分别收集常、乏氧条件下以LPS刺激成熟的小鼠BM-DC,流式细胞术检测其成熟相关表型。结果显示,乏氧条件下诱导分化并以LPS刺激的DC仍保持未成熟或半成熟的表型特征,其表面CD80,CD86以及MHC-Ⅱ类分子的表达,无论是百分比,还是平均荧光强度,均显著低于LPS刺激的常氧成熟DC,其中MHC-Ⅱ类分子的平均荧光强度(MFI)降低尤为明显(P＜0.01),表明LPS不能诱导乏氧条件下分化DC表面协同刺激分子以及MHC-Ⅱ类分子的表达上调,提示乏氧微环境可抑制DC的表型成熟。3.乏氧抑制DC炎性细胞因子IL-1,IL-6和TNF-α的分泌以及MMP9的产生,上调免疫抑制因子TGF-β的分泌为了研究乏氧微环境是否影响DC的细胞因子分泌及迁移等功能,我们分别收集常、乏氧条件下以LPS刺激成熟的小鼠BM-DC,采用RT-PCR和ELISA方法检测评价相关细胞因子和基质金属蛋白酶MMP9的表达水平。结果显示,乏氧条件下诱导分化的DC,其IL-1β,IL-6和TNF-α的mRNA和蛋白表达水平均明显低于常氧成熟DC;而其TGF-β的mRNA和蛋白表达水平却显著高于常氧成熟DC,表明乏氧可抑制DC分泌炎性细胞因子IL-1,IL-6和TNF-α,但却上调免疫抑制因子TGF-β的分泌。此外,我们发现,较常氧成熟DC相比,乏氧条件分化并以LPS刺激的DC,其MMP9的mRNA水平明显降低,提示乏氧可能通过抑制MMP9的表达而抑制DC的迁移功能。4.乏氧抑制DC刺激同种异型CD4~+T细胞增殖的能力为了探索乏氧微环境对DC致敏T细胞能力的影响,我们分别以常、乏氧条件下诱导产生的C57BL/6小鼠的DC刺激来自BALB/c小鼠的CD4~+T细胞,用流式细胞术检测CD4~+T细胞增殖率的不同。结果显示,以LPS刺激成熟的常氧DC,可诱导约40-50%左右的CD4~+T细胞的增殖;然而乏氧条件分化并以LPS刺激的DC,其诱导同种异型CD4~+T细胞增殖的能力很弱,只能诱导大约10%左右的CD4~+T细胞的增殖,甚至显著低于常氧未成熟DC刺激CD4~+T细胞增殖的能力(30%左右),可见LPS诱导的乏氧DC其刺激CD4~+T细胞增殖的能力与常氧DC相比非常弱,说明乏氧微环境抑制LPS诱导的DC的功能成熟,尤其是其介导适应性免疫应答的能力。二、再氧合对乏氧DC表型及功能的影响1.再氧合促进乏氧DC的表型成熟为了研究氧气再给予对乏氧DC表型的影响,我们对乏氧条件下分化的DC进行不同时间的再氧合,流式细胞术检测DC表面成熟相关表型的变化。结果显示再氧合可已明显上调乏氧DC表面协同刺激分子CD80,CD86以及MHC-Ⅱ类分子的表达,且随时间延长其表达强度逐渐增强,再氧合6小时的DC其表面CD80,CD86以及MHC-Ⅱ类分子的表达已明显高于乏氧DC,至再氧合24到48小时达到高峰,甚至远高于LPS刺激的常氧成熟DC,呈现显著成熟的表型。这些结果提示,当给以充足的氧供,LPS刺激的乏氧DC具有完全甚至更强的向成熟DC分化的潜能。2.再氧合增强DC刺激CD4~+T细胞增殖的能力由于再氧合可导致乏氧DC的表型成熟,我们进一步研究了这些再氧合DC刺激CD4~+T活化增殖的能力。在同种异型增殖体系中,再氧合6小时的乏氧DC可强烈地刺激诱导CD4~+T细胞的增殖,其刺激CD4~+T细胞增殖的能力较乏氧DC显著提高,可刺激约71.1%的CD4~+T细胞增殖,远远超过常氧成熟DC对CD4~+T细胞的刺激增殖(增殖率约为40.5%)(P＜0.01)。在抗CD3抗体存在的同种同型增殖体系中,同样可以观察到再氧合DC可强烈刺激CD4~+T细胞的增殖(增殖率92.0%),显著高于常氧成熟DC对CD4~+T细胞的刺激增殖(增殖率约为71.7%)(P＜0.05)。提示再氧合可显著增强乏氧DC刺激CD4~+T细胞增殖的能力。3.再氧合DC诱导CD4~+T细胞向Th1细胞分化为了搞清再氧合DC对效应性T细胞分化的影响,我们用流式细胞术检测了混合淋巴细胞反应体系中CD4~+效应T细胞的亚群。结果发现,与乏氧或常氧条件下分化的DC相比,再氧合DC可显著诱导CD4~+T细胞向IFN-γ~+Th1细胞分化(约为9.1%),明显高于未成熟DC刺激产生的IFN-γ~+Th1细胞,甚至高于常氧成熟DC刺激产生的IFN-γ~+Th1细胞(约为6.8%);进一步的ELISA结果证实再氧合DC刺激体系中存在高水平IFN-γ,显著高于乏氧DC及常氧未成熟DC刺激体系(P＜0.05)。同时,再氧合DC可刺激CD4~+T细胞向IL-4~+Th2细胞分化,但其比例较少(约为2.1%);ELISA结果亦显示再氧合DC刺激体系中存在较高水平的IL-4。提示再氧合DC可诱导CD4~+T细胞向Th1和Th2细胞分化,但更倾向于使其向Th1细胞分化。三、CD137通路对乏氧DC表型及功能的影响1.CD137单抗上调乏氧DC的成熟表型为了研究CD137通路对乏氧DC的作用,我们分别检测了常、乏氧条件下诱导分化并以LPS刺激的DC表面CD137分子的表达情况,结果发现两者表面均有CD137分子的表达,但总体表达强度并不太高;乏氧具有轻微下调DC表面CD137表达的趋势,但未达到显著统计学差异。提示乏氧微环境对DC表面CD137表达的影响并不大。为了进一步探讨CD137分子的存在对乏氧DC的表型成熟的影响,我们用流式细胞术检测了CD137单抗刺激的乏氧DC表面协同刺激分子CD80,CD86以及MHC-Ⅱ类分子的表达。结果发现,乏氧条件下,刺激性CD137单抗可明显上调DC表面CD80,CD86以及MHC-Ⅱ类分子的表达,但无论是表达百分率还是表达强度均未达到常氧成熟DC表面的表达程度。这些结果表明CD137单抗可通过CD137分子促进乏氧DC向接近成熟的表型方向转变,但并不能促进其表型的完全成熟。2.CD137单抗可促进乏氧DC炎性细胞因子及MMP9的产生为了研究CD137通路对乏氧条件下分化DC迁移及炎性细胞因子分泌功能的影响,我们用RT-PCR法检测了DC中MMP9以及细胞因子IL-1β,IL-6,IL-12p40和TNF-α等的mRNA表达水平。结果发现,CD137单抗刺激可上调乏氧DC中炎性细胞因子IL-1β,IL-6,IL-12p40和TNF-α的mRNA水平,但未达到常氧成熟DC中的水平;此外,CD137单抗刺激亦可在一定程度上增加乏氧DC中MMP9的表达。提示CD137单抗不仅可促进乏氧DC炎性细胞因子的分泌;还可能通过MMP9的表达增加提高其迁移能力。3.CD137单抗对乏氧DC刺激CD4~+T细胞增殖能力的影响由于CD137单抗可在一定程度上刺激乏氧DC的表型成熟,我们进一步研究了CD137单抗对乏氧DC刺激CD4~+T细胞增殖能力的影响。我们用来自C57BL/6小鼠的CD137单抗刺激的乏氧DC作为刺激细胞,用来自BALB/c小鼠的CD4~+T细胞作为反应细胞,进行T细胞增殖实验,结果显示CD137单抗刺激的乏氧DC其诱导CD4~+T细胞增殖率略高于无CD137单抗作用的乏氧DC,但未达到统计学意义。提示CD137通路对乏氧DC诱导CD4~+T细胞增殖的能力无明显影响。结论一、乏氧抑制LPS诱导的DC成熟及功能1.乏氧可抑制LPS诱导的DC的成熟表型。2.乏氧可降低DC分泌炎性细胞因子IL-1,IL-6和TNF-α,增高免疫抑制因子TGF-β的表达。3.乏氧可抑制DC刺激CD4~+T细胞增殖的能力。二、再氧合促进乏氧DC的成熟及功能1.再氧合显著促进乏氧DC的表型成熟。2.再氧合显著增强乏氧DC刺激CD4~+T细胞增殖的能力。3.再氧合DC诱导CD4~+T细胞向Th1细胞分化。三、CD137通路可促进乏氧DC的成熟及其功能1.CD137单抗可上调乏氧DC的成熟表型。2.CD137单抗可促进乏氧DC分泌炎性细胞因子IL-1,IL-6,IL-12和TNF-α。3.CD137单抗对乏氧DC诱导CD4~+T细胞增殖的能力无明显影响。创新性一、在国内外率先证明乏氧可抑制小鼠LPS诱导的DC表型成熟,抑制其分泌炎性细胞因子及刺激CD4~+T增殖的能力,为研究乏氧微环境对免疫功能的影响提供了新的实验依据。二、首先发现再氧合可明显促进DC的表型成熟,显著增强DC刺激CD4~+T细胞增殖的能力,说明再氧合对乏氧抑制DC成熟及功能具有逆转效应,这对于解释缺血再灌注损伤的发病机制,控制器官移植的排斥反应以及肿瘤的免疫治疗等许多方面都具有重要的指导意义。三、首先发现CD137单抗可促进DC的表型成熟及炎性细胞因子的分泌。对于解释CD137抗体体内抗肿瘤的作用机制有一定价值。局限性一、再氧合促进乏氧DC成熟及功能的作用机制尚需深入研究。二、CD137单抗对乏氧DC的表型成熟及细胞因子分泌影响的机制和意义,以及CD137单抗刺激的乏氧DC刺激CD8~+T增殖的能力有待进一步研究。第二篇CD137和CD137L在人原发肿瘤组织中的表达及意义目的CD137作为肿瘤坏死因子超家族的一员,主要表达于活化的T淋巴细胞和NK细胞表面;其配体CD137L主要表达于抗原递呈细胞表面,如成熟的树突状细胞(dendritic cells,DC),活化的B细胞和巨噬细胞。CD137-CD137L介导的共刺激信号可增强T细胞活化,促进心脏同种异型移植物的排斥反应,清除实验诱导的小鼠肿瘤。然而,人类CD137和CD137L的表达并不局限于免疫细胞,人CD137-CD137L通路的功能也远比小鼠复杂。CD137蛋白已被证明可表达于原发恶性肿瘤的血管壁;CD137L亦被发现可表达于几种不同的人类肿瘤细胞系,体外实验证明其是有功能的。迄今为止,关于CD137L在人类原发肿瘤中的表达尚无研究报道。因此,本研究的目的主要是分析CD137和CD137L在人类原发肿瘤中的表达,并深入研究它们在肿瘤免疫中的潜在作用。方法一、病例收集:63例组织标本来自山东大学齐鲁医院的手术病人,其中包括12例正常组织,15例上皮及间叶组织来源的良性肿瘤组织(腺瘤和平滑肌瘤),36例上皮来源的恶性肿瘤组织(鳞状细胞癌和腺癌)。二、免疫组织化学法分析CD137和CD137L在上述冰冻切片中的表达。三、RT-PCR法分析CD137L在9株人类肿瘤细胞系中的mRNA表达,其中包括3株肝癌细胞系,2株肺癌细胞系,2株结肠癌细胞系,1株淋巴瘤和1株白血病细胞系。四、为了分析肿瘤细胞表面CD137L的作用,将表达CD137L的肿瘤细胞与表达CD137的活化T淋巴细胞或CHO细胞共培养,ELISA法检测细胞因子(IL-8,IFN-γ)的表达水平。结果一、人类原发肿瘤组织可表达CD137和CD137L,但其表达部位不同CD137和CD137L仅表达于人类良性(2/15,3/15)或恶性(15/36,21/36)肿瘤组织中,但不表达于正常组织中(0/12,0/12)。CD137表达于肿瘤组织血管壁的上皮细胞和平滑肌细胞,而CD137L表达于肿瘤细胞。尽管样本来自于不同的组织类型,CD137和CD137L的表达更常见于恶性肿瘤组织,尤其是中度或低度分化的恶性肿瘤组织。三、人类肿瘤细胞系表达高水平的CD137L上述实验结果显示人类原发肿瘤组织中的肿瘤细胞可表达CD137L,我们进一步用RT-PCR法检测了来源于不同原发组织的肿瘤细胞细胞系表面CD137L的表达。结果显示,正常未刺激的外周血单个核细胞不表达CD137L mRNA,但所有检测的肿瘤细胞系(HepG2.2.15,BEL7402,HLE,HT29,L78,A2,U937,HL60,H6)均显示高水平的CD137L表达。出乎意料的是非肿瘤细胞系,人脐静脉内皮细胞系ECV304也表达CD137L。这些结果显示CD137L不仅表达于人类的原发肿瘤组织,也表达于肿瘤细胞系和一些非肿瘤细胞系,提示CD137L的表达可能与细胞的快速生长有关。三、肿瘤细胞表达的CD137L是有功能的为了研究肿瘤细胞表面CD137L的功能,我们将表达CD137L的肿瘤细胞与表达CD137的活化T淋巴细胞共培养,ELISA法检测IFN-γ的分泌。结果显示,与不CD137的静息T细胞相比,表达CD137的活化T淋巴细胞与L78细胞共培养可产生高水平的IFN-γ(P＜0.001),用抗CD137L单抗封闭CD137-CD137L通路,IFN-γ的分泌水平则明显降低(P＜0.001)。为了验证表达于肿瘤细胞表面的CD137L能否向肿瘤细胞传递信号,我们将不同的肿瘤细胞与表达CD137的CD137-CHO细胞共培养,ELISA法检测IL-8的表达。结果显示HepG2.2.15表面的CD137L与CD137-CHO表面的CD137交联可促进肿瘤细胞IL-8的分泌(P=0.038)。结论一、CD137和CD137L可表达于不同的人类原发肿瘤组织,但其表达部位不同。CD137表达于肿瘤组织血管壁的上皮细胞和平滑肌细胞,而CD137L表达于肿瘤细胞。二、肿瘤细胞表达的CD137L是有功能的,肿瘤细胞L78表面的CD137L与T细胞表面的CD137交联可诱导T细胞产生高水平的IFN-γ,HepG2.2.15表面的CD137L与CD137的交联可促进肿瘤细胞分泌IL-8,从而提示肿瘤组织中CD137和CD137L的表达可影响肿瘤的发展。创新性首次证明CD137和CD137L可表达于不同的人类原发肿瘤组织,肿瘤细胞表达的CD137L是有功能的,从而提示肿瘤组织中CD137和CD137L的表达可影响肿瘤的发展。局限性病例数有限,需扩大病例数以进行深入研究;对CD137和CD137L的表达分析,需进一步收集相同组织来源的标本进行研究。