研究背景：甲型流感是甲型流感病毒(influenza A virus, IAV)引起的急性呼吸道传染病。在20世纪已经爆发过4次世界范围的甲型流感病毒大流行,其中死于1918年西班牙流感的人数多达2000～5000万。1997年香港爆发了高致病性H5N1禽流感,截止至2015年1月6日,世界卫生组织(WHO)报道了694例H5N1禽流感病毒感染确诊病例,其中402人死亡,死亡率高达57.92%,死亡者多为青壮年。2009年新甲型H1N1流感病毒造成世界范围的流感爆发,确诊病例超过130万人,其中1.4万人死亡,给人类健康带来巨大威胁。2013年我国等多省(市)发生不明原因重症肺炎病例,至2013年5月27日共确诊人感染H7N9亚型禽流感病毒130例,其中死亡37人,死亡率接近30%。上述感染案例表明H5N1、H7N9禽流感病毒可以跨越宿主从禽类感染到人类,而现有疫苗却无法预防。2012年的两项关于H5N1获得哺乳动物间传播能力的研究表明,H5N1禽流感病毒的血凝素蛋白仅需发生4个位点的突变,就能在哺乳动物雪貂间进行空气传播。若具有高致死率的H5N1禽流感病毒突变后获得人传人的空气传播能力,将导致巨大的社会恐慌和更高死亡率。目前市场上的靶向病毒的特异性抗流感药物,根据作用机制可分为两类：1)M2离子通道阻断剂,如金刚烷胺和金刚乙胺,它们通过阻断M2离子通道蛋白以阻止病毒脱壳。然而,大部分流感病毒株已经对这两个药物耐药。2)神经氨酸酶抑制剂(neuraminidase inhibitor, NAI),FDA批准上市的有扎那米韦和奥司他韦(Oseltamivir,达菲),是目前抗流感一线药物。NAI通过抑制神经氨酸酶活性,抑制唾液酸受体的切割,导致子代病毒无法释放。虽然感染H5N1禽流感的病人均采用了NAI治疗,死亡率仍很高,对NAI耐药的毒株也不断被分离到。值得注意的是,2014年4月Tom Jefferson综合分析Roche公司被迫公开的临床数据及其他临床数据,发现目前数据不能证实NAI类能降低流感的致死率和住院率及儿童肺炎的并发率。因此,目前急需研究针对新靶点的药物防治流感。血凝素蛋白(hemagglutinin, HA)介导病毒感染早期的入胞功能,靶向HA新靶点的流感病毒进入抑制剂是目前抗流感药物研究热点。值得注意的是,病毒进入抑制剂可降低病毒的入胞感染能力甚至达到中和病毒的效果,可有效地阻断流感的发病和传播。血凝素HA由病毒基因的片段4编码,其空间构型类似于“蘑菇”镶嵌在病毒包膜上,“蘑菇”的球形头部由3个HAl亚基构成,含有受体结合位点和抗原决定簇,可结合细胞膜表面糖蛋白的末端唾液酸受体；“蘑菇”的柄部主要由3个HA2亚基组成,插入病毒包膜。在胞内体酸性(pH 5.0～6.0)条件下,HA1亚基变构打开融合肽(fusion peptide,FP)口袋,同时HA2亚基中的B环转化为a-螺旋结构,导致FP从口袋中弹出并插入胞内体膜,变构释放的能量将病毒拉近胞内体从而介导膜融合,促进病毒核衣壳释放入胞。然而HA中存在大量宿主识别的抗原靶位,病毒为了逃避宿主免疫识别,其血凝素蛋白HA1亚基突变较大,不过HA2亚基的则非常保守。因此靶向HA2的病毒融合抑制剂可能广谱抑制流感病毒,减少耐药毒株产生的可能。防控流感病毒的爆发流行主要措施之一就是消灭传染源,故流感流行期间杀病毒剂的使用非常重要。如果流感病毒进入抑制剂可以与病毒的血凝素不可逆性结合,干扰血凝素介导的入胞功能,也可能具有灭活病毒的作用。对流感病毒有灭活作用的消毒剂可分为：表面活性剂类、碱类、酸类、氯及其衍生物、氧化剂、醛类、酚类、醇类和季胺类化合物(QACs)。绝大部分的消毒剂的灭活病毒的最佳温度均在20℃以上,且对人体有一定的毒性或刺激性,极大地限制了其的应用范围。此外,环境中广泛存在的有机物对碱类、氧化剂类、醛类、季胺类、氯及其衍生物类杀病毒剂的杀病毒作用影响极大,因此使用此类消毒剂时必须进行表面清洁以去除有机物才能保证其杀病毒效能。然而,靶向HA的杀病毒剂特异性高,可能对环境温度和有机物浓度要求较低。在病毒进入抑制剂的研究上,目前采用靶向HA的假病毒筛选体系可以寻找特异性病毒入胞抑制剂。本课题组采用H5N1假病毒高通量筛选模型和分子对接等方法曾发现了两类小分子化合物能特异性抑制HA2亚基,从而抑制禽流感病毒入胞。①课题组研究曾发现化合物CL-385319的苯环通过π-π共价与H5N1流感病毒HA2亚基靶穴中芳香环氨基酸残基结合。针对此药物靶穴设计的新化合物1L,其噻吩环增强了其苯环与HA的π-π共价结合力,因而其抗H5N1病毒的活性提高,提示化合物1l与HA的π-π共价结合是其抑制病毒的关键。②课题组基于H5N1假病毒模型还发现了新型皂苷系列小分子H5N1禽流感病毒进入抑制剂,其中化合物3(熊果酸甲酯皂苷)活性最高,进一步构效关系研究发现,化合物1-3结构中的马铃薯三糖和苷元均为活性必要片段。目的：本研究以流感病毒包膜上的血凝素蛋白(hemagglutinin,HA)作为新型抗流感药物的作用靶点,建立假病毒高通量筛选模型,基于本实验室发现的病毒进入抑制剂分子骨架,合理设计小分子类流感病毒进入抑制剂,并筛选其抑制H5N1流感病毒进入的活性；进一步研究活性化合物抑制H5N1流感病毒入胞的机制;针对血凝素的易突变性,对机制明确的化合物,继续研究其是否广谱抑制或中和H1N1甲型流感活病毒。具体化合物及筛选库设计如下：1.基于HA靶穴π-π：共价结合的机制,我们设计寡聚噻吩类衍生物,推测其与诱导靶穴产生更强的π-π共价结合,因而活性有可能提高。2.基于病毒进入抑制剂化合物3(3-o-p-马铃薯三糖-熊果酸甲酯皂苷),构效关系研究苷元替换及苷元周围羧基的酯酰修饰或酰胺转换；基于抑制活性对糖链结构严格依赖,我们只将苷元上糖苷键连接的3-OH从p构象改变为α构象。方法：1.采用H5N1假病毒的筛选模型筛选小分子化合物的抑制活性：测序鉴定用于假病毒包装的关键质粒,即表达毒株A/Thailand/Kan353/2004(H5N1)血凝素靶点的HA质粒；采用PEI转染试剂将核心质粒pNL4.3 R E、流感包膜质粒 HA、NA转染293T细胞,包装H5N1流感假病毒；假病毒感染48h后,检测宿主MDCK细胞中报告基因荧光素酶的催化发光强度反映病毒的进入量。2.MTT法检测药物的细胞毒性和病毒导致的细胞病变(CPE)：小分子化合物作用于MDCK细胞48h后检测药物对细胞的毒性,采用Calccusyn软件计算细胞半数毒性浓度；在给药或不给药的条件下,病毒感染MDCK细胞48h后采用MTT检测细胞活力,采用Reed-Muench法计算药物对病毒导致细胞病变的抑制活性。3.针对病毒包膜蛋白的生物活性和滴度检测：针对病毒血凝素蛋白,采用血凝滴度法检测流感病毒或假病毒的血凝滴度,对照组采用哈尔滨兽医研究所提供的H5抗原和相应抗血清；针对病毒神经氨酸酶,采用神经氨酸酶抑制剂筛选试剂盒或WHO Standard Operating Procedure的实验方法检测神经氨酸酶活性,培养上清的神经氨酸酶活性可反映其流感病毒含量。4.采用假病毒体系初步判定活性化合物特异性靶向HA:包装病毒核心相同但是包膜为VSVG的VSV假病毒,如果药物特异性抑制H5N1流感假病毒且对VSV假病毒无效,则药物特异作用于流感假病毒的包膜蛋白；采用神经氨酸酶抑制剂筛选试剂盒检测药物对NA的抑制活性,若无抑制作用则可推测药物特异性作用于HA。5.观察药物与HA2亚基的相互作用：采用血凝抑制实验观察药物抑制病毒入胞机制是否通过抑制病毒HA1亚基吸附受体；采用表面等离子共振法(SPR)检测化合物与HA蛋白及其HA2亚基的亲和力。6.观察药物对H1N1流感活病毒A/Puerto Rico/8/34(H1N1)抑制活性和机制：鸡胚扩毒,采用Reed-Muench法计算病毒TCID50滴度；观察在全程给药、吸附之前药物与病毒共孵或病毒吸附之后给药三种模式下,药物对H1N1流感活病毒的抑制活性；采用加药时间点的方法观察药物是否作用病毒复制的早期阶段;采用免疫荧光法观察药物对病毒蛋白表达的影响。7.动物实验观察药物是否中和病毒,阻断病毒对宿主的感染。8.采用SPSS19.0软件进行数据分析。正态分布数据的组间比较采用单因素方差分析,Levene方差齐性检验检查方差齐性,方差齐的数据用LSD法进行两两比较,方差不齐的数据采用Dunnett T3法进行两两比较,数据用Mean±SD表示。生存率分析采用寿命表法；体重-时间曲线数据采用重复测量资料的方差分析。结果：1.基于π-π共价结合靶穴设计的寡聚噻吩类化合物、进入抑制剂化合物3衍生的五环三帖皂苷类化合物对H5N1亚型流感病毒入胞都具有抑制作用,其抑制活性的ICso分别可达0.029～74 μM,0.98～22.5 μM;且细胞毒性较小,抑制H5N1流感假病毒的选择指数分别为2.08～1169.59,3.5-162.6。2.寡聚噻吩类化合物的构效关系表明,连接碳链长为4的化合物其抑制H5N1假病毒活性比连接碳链长为3的化合物提高10-100倍(3sf>3sc,3sk>3sh, 3si> 3sg,3se>3sb,2sd> 2sb);强效活性化合物(IC50<1μM)如2sd,3sf,3si, 3sk,4sc分子结构中噻吩环的数量≥2,提示寡聚噻吩环是该系列化合物的分子骨架。3.皂苷类化合物的构效关系分析表明,苷元17-COOH的酯酰或酰胺化及苷元的3-OH由β位变构为α位均明显改善药物毒性和选择性。4.通过假病毒模型体系初步认定连接碳链长度为3的寡聚噻吩类化合物(以4sc为代表)和皂苷类化合物(以化合物15为代表)特异性作用于血凝素HA,这是因为化合物4sc和化合物15对VSV假病毒进入无抑制作用且不抑制流感病毒的NA(组间比较没有统计学差异,p>0.05)。5.化合物4sc和化合物15不抑制病毒吸附红细胞所引起的血凝,提示其不抑制病毒的吸附作用,可能抑制HA2亚基的融合功能；采用分子对接证实化合物15结合于HA2亚基靶穴的酸残基Lys-26、Asn-50、Asn-53、Asp-57。6.SPR检测表明寡聚噻吩类化合物4sc、3sc以及皂苷类代表化合物14、15均与HA蛋白结合,进一步研究发现4sc、3sc、14、15可以与HA2亚基结合。7.进一步在H1N1亚型流感活病毒PR8感染MDCK细胞模中检测活性化合物是否广谱抗流感：与假病毒筛药模型的给药方式保持一致,采用全程给药模式,即病毒与药物共孵育30 min后加入MDCK细胞,病毒吸附完成后继续维持药物；全程给药模式下,寡聚噻吩类化合物3sf、3sk、3sc、4sc均能强效抑制PR8病毒感染后子代病毒的产量,IC50分别为1.22±0.12μM,3.67±0.47μM,1.35±O.10 μM和0.76±0.13μM；然而,皂苷类化合物15在全程给药模式下不能抑制PR8病毒。8.寡聚噻吩类化合物的抑制流感病毒活性可能为杀病毒效应：在治疗模式下,即病毒吸附完成后加入寡聚噻吩化合物3sf、3sc、4sc不能抑制PR8子代病毒的产生；故采用直接模式,即病毒与药物共孵育30min后吸附MDCK细胞1h,弃上清后用PBS清洗2遍,实验结果表明在化合物3sf、3sc、4sc被洗脱后,PR8病毒不能恢复感染能力,其抑制病毒诱导细胞病变(CPE)的IC50分别为0.275±0.089 μM,0.214±0.048μM,0.047±0.009μM,提示其杀病毒不能被洗脱所逆转。9.靶向HA的化合物4sc抑制PR8病毒的活性和选择性最高,故选择化合物4sc做后续研究。加药时间点实验证实只有在病毒吸附细胞之前用4sc预处理病毒才能抑制PR8病毒,病毒吸附完成时立即加入4sc不能抑制PR8病毒。10.观察4sc是否特异性靶向病毒：鉴于病毒吸附MDCK细胞期间化合物4sc也处理了MDCK细胞1h,故用4sc预处理MDCK细胞1h后用PBS洗脱,结果表明被化合物4sc预处理MDCK细胞不能免疫病毒感染；另一方面,4sc预处理的PR8病毒在4sc稀释至无效浓度0.016μM时未恢复任何感染能力,提示稀释不能逆转其杀病毒作用。这些结果提示化合物靶向病毒而不是宿主。11.观察温度和有机物对4sc杀病毒作用的影响：10μM4sc杀病毒处理病毒15min可使富含有机物的鸡胚尿囊液中病毒滴度降低105.03±0.30倍(**p<0.05, vs Stock solution group);化合物4sc在4℃与37℃杀病毒的量效曲线接近,IC50分别为3.167±0.147μM和2.858±0.069μM；H5N1假病毒模型中,培养基胎牛血清含量为10%,4sc仍具有杀病毒作用。12.接种量为5 LD50 PR8病毒通过滴鼻接种于小鼠体内。病毒对照组小鼠在感染后的第6-10天全部死亡,生存时间中位数为8.5天；而20μM或2μM4sc预处理的PR8病毒对小鼠无明显损伤作用,小鼠几乎没有出现感染症状,更没有出现任何小鼠死亡(**p<0.001 vs Virus control),且小鼠体重正常增加(**/p<0.05 vs Virus control)。结论：1.基于π-π共价结合靶穴设计的寡聚噻吩类化合物4sc和-o-p-马铃薯三糖-熊果酸甲酯衍生的皂苷类化合物15都可特异性靶向病毒血凝素HA2亚基,从而抑制H5N1及H1N1亚型流感病毒入胞,抑制活性IC50可分别达nM级和μM级；2.寡聚噻吩类化合物4sc在体外和体内模型中均具有强效杀H1N1亚型流感活病毒作用,温度和有机物对其杀病毒作用影响较小,且其细胞毒性很小,可作为特殊用途的杀病毒剂开发;3.化合物3衍生的皂苷化合物抑制H5N1流感入胞的活性接近或高于母体化合物,但是苷元17-COOH的酯酰或酰胺转化及苷元的3-OH由p位变构为α位均显著改善药物毒性和选择性,皂苷类化合物15作用于HA2亚基靶穴的氨基酸残基Lys-26、Asn-50、Asn-53、Asp-57。