糖尿病是一类由遗传、环境、免疫等因素引起的严重危害人类健康的常见病、多发病。目前全世界有大约2.5亿的糖尿病患者,预计到2025年患者总数将达到3.8亿。我国是世界上糖尿病患者最多的三个国家之一,其中90%以上为2型糖尿病(Type 2 diabetes, T2DM),其并发症可累及机体各重要器官,也因此成为继癌症和心脑血管病之后威胁人类健康的第三大“杀手”。随着人口老龄化、饮食结构西化和久坐等不良生活方式的流行,T2DM患病率上升的势头有增无减,因此,对其发病机制的研究和寻找其有效的治疗靶点具有十分重要的临床意义。本课题组前期的实验结果表明：从荚膜黄芪的根中提取的含量最大的水溶性多糖成分——黄芪多糖(Astragalus polysaccharides, APS)能够有效降低T2DM动物的高血糖、增加其胰岛素敏感性并改善其胰岛素抵抗状态,关键是相对于临床上化学降糖药物而言具有对机体的毒、副作用小的优势。其胰岛素增敏机制与减少蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B (Protein tyrosine phosphatase 1B, PTP1B)的表达有关,但其中的具体机制尚未完全明了。本研究通过高脂饮食喂养联合小剂量链脲佐菌素腹腔注射建立T2DM大鼠模型,并结合体外实验进一步探讨APS对T2DM大鼠胰岛素抵抗的作用及其降低PTP1B表达的机制。研究分为以下三个部分的实验。目的：胰岛素抵抗是T2DM最特征性的表现,内质网应激(Endoplasmic reticulum stress, ERS)是肥胖、胰岛素抵抗和T2DM之间关键的分子联系机制。黄芪多糖(Astragalus polysaccharides, APS)是荚膜黄芪的根中提取的含量最大的水溶性多糖成分,本实验通过建立T2DM大鼠模型,予以APS治疗,观察APS对T2DM大鼠血糖水平、胰岛素敏感性和ERS及胰岛素信号分子表达的作用,旨在探讨APS对T2DM大鼠胰岛素抵抗的作用及其可能机制。方法：采用高脂饮食联合25mg/kg链脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)腹腔注射建立T2DM大鼠模型。模型复制成功后,实验分为正常组(C组)、APS处理正常大鼠组(C+APS组)、T2DM组(DM组)和APS处理T2DM大鼠组(DM+APS组)。C+APS组和DM+APS组给予APS(700mg/kg/day)灌胃处理8周,同时C组和DM组给予等体积生理盐水灌胃处理8周。通过检测空腹和随机血糖、口服葡萄糖耐量试验和糖基化血红蛋白(Glycosylated hemoglobin, GHb)、血清胰岛素并计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)评价APS对T2DM大鼠的血糖水平和胰岛素敏感性的作用；用免疫印迹法检测T2DM大鼠肝脏组织中介导ERS反应的重要信号分子磷酸化的需肌醇酶(Inositol requiring enzyme 1, IRE1)、激活转录因子6 (Activating transcription factor 6, ATF6)的无活性形式(p90-ATF6)和活化形式(p50-ATF6)的表达评价APS对ERS信号的作用；分别用免疫印迹法和RT-PCR法检测PTPlB的蛋白和mRNA表达评价APS对胰岛素信号传导的作用。结果：(1)DM组随机血糖、空腹血糖、口服葡萄糖耐量试验各时点血糖水平均显著高于C组,但上述指标在DM+APS组较DM组明显降低,C+APS组与C组之间无显著差异,DM组糖基化血红蛋白水平高于C组,DM+APS组糖基化血红蛋白较DM组明显降低；(2)胰岛素水平在各组之间均未见显著性差异,但DM组HOMA-IR评分明显高于C组,DM+APS组的HOMA-IR评分较DM组则显著降低,C组和C+APS组之间无明显差异；(3)DM组肝脏组织中磷酸化IRE1和活化的ATF6(p50-ATF6)的表达显著高于C组,而p90-ATF6的表达低于C组,DM+APS组肝脏组织中磷酸化IREl和p50-ATF6的表达显著低于DM组,但p90-ATF6的表达显著高于DM组；上述蛋白的表达在C组和C+APS组之间无明显差异；(4)DM组肝脏PTPlB的蛋白和mRNA表达高于C组,DM+APS组PTP1B的蛋白和mRNA表达较DM组显著降低,APS对正常大鼠PTPlB的表达未见明显影响。结论：(1)APS能显著降低高脂饮食联合小剂量STZ诱导的T2DM大鼠血糖水平、改善其葡萄糖耐量和增加其胰岛素敏感性；(2)APS能显著减轻T2DM大鼠肝脏的ERS反应；(3)APS能降低T2DM大鼠肝脏PTP1B的mRNA和蛋白的高表达,这可能是其降血糖、增加胰岛素敏感性和减轻ERS作用的重要机制。目的：蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B (Protein tyrosine phosphatase 1B, PTP1B)作为调节胰岛素信号的重要负性调控因子在细胞内主要锚定在内质网膜,起着加强介导ERS的重要蛋白分子需肌醇酶1 (Inositol requiring enzyme 1, IRE1)信号的作用,且这种作用依赖于PTPlB酪氨酸磷酸酯酶的活性,但PTPlB并未直接影响IRE1的磷酸化状态。激活转录因子6(Activating transcription factor 6, ATF6)是内质网膜上介导ERS的重要信号蛋白,主要起着活化各种涉及ERS的转录因子以及蛋白质折叠所需要的各种结合蛋白和酶类的表达的作用。我们推测PTPlB的表达可能受到ATF6活化的调节。本实验在体外分别通过毒胡萝卜素(Thapsigargin,TG)、高浓度葡萄糖和胰岛素建立ERS和胰岛素抵抗的细胞模型,旨在探讨ERS诱导的ATF6的活化对PTP1B表达的调控作用。方法：实验分为3个大组：(1)在人正常肝细胞株HL-7702中瞬时转染编码活化形式的ATF6(p50-ATF6)的pCI-Flag-ATF6(N)(2-366)质粒和对应的空质粒,分别用免疫印迹法和RT-PCR法检测PTP1B的蛋白和mRNA表达；(2)用TG、高胰岛素(5×10-7mol/L)和不同浓度的D-葡萄糖处理细胞,用免疫印迹法检测p50-ATF6的蛋白表达确定可诱导ERS的D-葡萄糖和胰岛素浓度；(3)建立TG、高糖和高胰岛素诱导的细胞模型,用AEBSF作用ATF6的活化抑制剂预处理细胞,分别用免疫印迹法和RT-PCR法检测PTP1B的蛋白和mRNA表达,实验分为以下各组：①对照组(Vehicle组)、TG组、AEBSF+TG组、AEBSF组②对照组(Vehicle组)、高糖组(HG组)、AEBSF+高糖组(AEBSF+HG组)、AEBSF组③对照组(Control组)、高胰岛素组(Ins组)、AEBSF+高胰岛素组(AEBSF+Ins组)、AEBSF组结果：(1)瞬时转染pCI-Flag-ATF6(N)(2-366)质粒组活化形式的ATF6(p50-ATF6)的表达和PTP1B的mRNA表达较空质粒对照组明显增加,无活性形式ATF6(p90-ATF6)和PTP1B的蛋白表达未见显著改变；(2)25mmol/L D-葡萄糖、35mmol/L D-葡萄糖、5×10-7mol/L胰岛素与2μmol/LTG组p50-ATF6的表达各组间无明显差异,但与正常组相比均显著增加；(3)TG组、HG(25mmol/L D-葡萄糖)组、Ins(5×10-7mol/L胰岛素)组PTP1B的mRNA和蛋白表达较各自的正常对照组均显著增加,但经AEBSF预处理的AEBSF+TG组、AEBSF+HG组和AEBSF+Ins组的PTP1B的mRNA和蛋白表达分别显著低于TG组、HG组和Ins组,AEBSF组与各对照组之间未见显著性差异。结论：(1)正常人肝细胞中,通过瞬时转染过表达p50-ATF6可增加PTP1B的mRNA表达,对其蛋白的表达未见显著影响；(2)TG、高糖和高胰岛素均能诱导人正常肝细胞发生ERS；(3)在TG诱导的ERS细胞模型和高糖及高胰岛素诱导的胰岛素抵抗细胞模型中,ATF6活化均参与了调节PTP1B的蛋白和mRNA的表达。目的：APS可能通过减少T2DM大鼠肝脏组织中PTPlB的高表达降低其血糖水平、增加其胰岛素敏感性和减轻其ERS反应。在ERS和胰岛素抵抗的细胞模型中,PTP1B的表达受到介导ERS的跨膜蛋白ATF6活化的调节。因此,本实验将进一步研究APS是否通过阻止ATF6的活化而抑制PTP1B的表达。方法：(1)通过MTT法检测不同浓度的APS对HL-7702细胞的毒性；(2)用25mmol/L的D-葡萄糖诱导HL-7702细胞后,予以不同浓度的APS(0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.6mg/ml)处理,用免疫印迹法检测p50-ATF6和PTP1B的蛋白表达；(3)用25mmol/L的D-葡萄糖诱导HL-7702细胞后,予以0.4mg/ml APS处理,实验分为正常组(C组)、高糖组(HG组)APS处理高糖组(APS+HG组)和APS正常对照组(APS组),用免疫荧光法检测ATF6在细胞内的定位。结果：(1)APS在0-1.6mg/ml的范围内对HL-7702细胞无明显细胞毒性,各组之间细胞增殖率无明显差异；(2)0.1-0.8mg/mlAPS能够减少25mmol/L D-葡萄糖诱导的活化形式的ATF6(p50-ATF6)表达的增加,且0.2-0.8mg/ml APS处理组中p50-ATF6表达显著高于0.1mg/ml APS处理组；同时0.2-0.8mg/ml APS处理组PTP1B的蛋白表达均显著低于正常对照组,且0.4mg/ml APS处理组明显低于0.2mg/ml和0.8mg/ml APS处理组,0.2-0.8mg/ml APS处理组中p50-ATF6的表达和的PTP1B表达之间存在显著正相关关系；(3)在正常组,红色的荧光(同时标记p50-ATF6和p90-ATF6)呈点状散在分布在细胞浆中,细胞核内着色很少；HG组的红色荧光集中分布于核周,核内的红色荧光也增多；APS+HG组与HG相比细胞核内和核周的红色荧光减少,胞浆中散在分布的荧光明显增强；APS组红色荧光的分布与正常对照组相比无显著差异,细胞核内和核周的荧光较少,红色荧光主要散在分布在细胞浆中。结论：(1)APS可同时减少高糖诱导的PTP1B的表达和抑制高糖诱导的ATF6的活化及活化后向细胞核的转位；(2)APS至少部分通过阻止高糖诱导的ATF6活化抑制PTP1B的高表达。