喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell cancer，LSCC)是东北地区高发的肿瘤，其病因不明，探讨喉癌发生的分子机制是进行有效的临床诊治的基础。喉癌的遗传学研究资料有限，大多为已知单个基因的突变和表达研究，如ras、c-Myc、EFGR、PRAD、Int-2等癌基因和p53、Rb、p16、FHIT等抑癌基因与喉癌相关性的报道，迄今尚未发现喉癌相关基因克隆的报道。因此，开展喉癌相关基因的分离、克隆及定位研究无疑是一个重要课题。 随着人类基因组测序及生物信息学的快速发展，产生了大量可供利用的基因组信息和分析软件。充分利用这些数据和工具来寻找新基因，了解基因的功能及其与人类疾病的关系，是功能基因组学研究的主要任务，也是目前基因克隆的主要策略之一。 本实验室在前期喉癌组织原代培养和杂合性丢失(loss of heterozygosity，LOH)研究中发现，染色体6q25区域存在高频率的缺失，但目前没有该区域中存在喉癌相关基因的报道。我们在此基础上，采用以表达序列标签(expressed sequence tag，EST)为电子探针，在人类基因组数据库中进行电子杂交，钓出相应的基因组序列并预测新基因的方法，大规模筛选喉癌相关新基因。本研究运用这一策略首次成功克隆到一个新基因，并对其生物学特性作了初步分析。 材料与方法 1 材料与试剂 喉癌组织及癌旁组织取自解放军463医院耳鼻喉科手术切除标本； TRIZOL Reagent、Taq DNA聚合酶购自GibcoBRL公司； 反转录试剂盒、DNA纯化试剂盒购自Promega公司； pEGFP-C3载体、Lipofectamin2000脂质体转染试剂盒购自Invitrogen 当前计算机克隆新基因大多采取EST拼接策略，通过对EST数据库中的序列进行分类、整合、组装，直接获得大片段或全长cDNA序列。从这种途径克隆得到的新基因一般是已知基因的同源基因，不能直接了解其与疾病发生的关系。本研究在细胞遗传学研究的基础上，借用EsT数据库和人类基因组数据库的信息预测相关染色体区域的新基因，直接筛选疾病相关新基因，是一种有效的候选定位克隆的新策略。通过这种方法，我们成功克隆了一个喉癌相关新基因，将其命名为MTLC(c一Myc target伽ml呵nge滋canc-er eells)。 Northem blot分析表明MTLC基因在多种组织中有表达，提示该基因可能对维持细胞的正常生理功能是必需的。对MTLC基因启动子区的分析显示其中存在两个c一Myc结合位点，表明它可能是。一Myc的一个靶基因。。一Myc作为转录因子的功能非常广泛，现有研究表明其下游靶基因参与细胞转化、分化、凋亡和细胞周期调控，还可促进细胞生长和血管生成，并可诱导基因组不稳定。对MTLC基因编码蛋白的氨基酸序列分析表明其中只存在一个核定位信号结构域，亚细胞定位实验也表明该基因在细胞核表达，这提示MTLC基因可能作为C一Myc的一个下游基因以转录因子的形式在细胞信号传导通路中发挥重要作用。 RT一PCR研究表明MTLC基因在喉癌组织中表达下调;而细胞转染实验证实MTLC过表达可抑制喉癌He哗细胞生长并促进其凋亡，这些结果表明MTLC基因可能对喉癌的发生有重要的作用。本研究为进一步了解MTLC基因的功能及其在细胞信号传导通路中的位置打下了良好的基础。结论 1首次应用生物信息学手段克隆了一个喉癌相关新基因，命名为MTLC，GenBank登录号AF527367。该基因位于6够5 .2，全长约Zlkb，eDNA长1 006bp，编码235个氨基酸。 2 MTLC基因在多种组织中有表达，其中肝脏中表达最高。亚细胞定位实验表明MTLC基因主要在细胞核表达。 3 MTLC基因在喉癌组织中表达下调，并可抑制喉癌细胞系He衅细胞生长、促进凋亡，提示MTLC可能与喉癌形成有关。