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背景和目的miRNAs（microRNAs）是一组长约2023个核苷酸序列的非编码RNA,其主要通过和靶基因mRNA的3’UTR碱基配对,促进mRNA的降解和/或抑制mRNA的翻译过程。大量研究已经证实miRNAs是多种生物学过程中关键的调节因子,比如细胞的增殖、分化、凋亡、癌变及组织器官的发育等。研究发现,人类编码miRNA的基因大约占基因组的3%,然而miRNA却调控着约60%的人类蛋白编码基因,说明miRNAs在生物学过程中的调节功能非常重要。同时越来越多的研究证明miRNAs在骨发育、成骨分化、破骨分化及骨质疏松等方面有着重要作用,miRNAs在骨形成过程中所起到的调节作用,已经成为当前的研究热点。胸椎黄韧带骨化（thoracic ossification of ligamentum flavum,TOLF）是一种常见的胸椎韧带异位骨化性疾病,发病隐匿,TOLF近些年在我国发病有增多趋势,且是造成胸椎管狭窄、胸椎脊髓病最常见的病因。虽然已有很多研究报道了miRNAs在多种组织骨化过程中具有重要的调控作用,然而,对于miRNAs在TOLF病理机制中的调控作用却很少有人研究。本研究使用小RNA高通量测序,通过比较TOLF细胞和正常黄韧带细胞miRNAs的表达,检测出TOLF细胞中显著性差异表达的miRNAs,并用qRT-PCR验证测序结果的准确性,对差异表达的miRNAs进行靶基因预测并对靶基因进行生物信息学分析,初步建立TOLF细胞成骨相关性miRNAs表达谱,为今后探索miRNAs对TOLF的临床诊治研究提供一定的实验依据。方法本研究共收集4例胸椎黄韧带骨化组织标本和4例正常黄韧带组织标本,其中正常黄韧带组织标本作为正常对照组,分别分离组织标本细胞,行免疫荧光鉴定,培养原代细胞。根据说明书,用Trizol试剂盒抽提组织标本总RNA,分别用Nanodrop和Agilent2100检测RNA的纯度和质量。应用Illumina HiSeqTM2000 analyser检测TOLF细胞和正常LF细胞的miRNAs表达谱。根据miRNA测序结果,选取符合条件的显著性差异表达的miRNAs,利用TaqMan miRNA Assays定量PCR试剂盒,对差异表达的miRNAs进行qRT-PCR验证。应用miRBase,miRanda和TargetScan数据库进行靶基因预测,得到差异miRNAs的靶基因。然后对差异miRNAs的潜在靶基因进行Gene Ontology（GO）和KEGG生物信息学分析。取差异miRNAs和GO和KEGG分析所属的基因,构建miRNAs与靶基因的调控网络。结果免疫荧光染色显示TOLF原代细胞具有成骨性细胞特征,LF原代细胞为成纤维细胞。我们发现TOLF细胞与LF细胞的miRNAs表达存在明显差异,共发现有7个表达具有显著性差异的miRNAs,其中4个高表达和3个低表达,同时qRT-PCR验证结果证明测序结果可靠性较高。7个miRNAs的潜在靶基因共有172个,对靶基因进行Gene Ontology（GO）和KEGG的生物信息学分析,GO分析提示靶基因参与多种分子功能（molecular function）,生物过程（biological process）和细胞组件（cellular component）,KEGG分析发现多个重要的成骨相关性信号通路（Notch信号通路、Wnt信号通路、TGF-β信号通路、PI3K/Akt信号通路等）。结论1.通过高通量小RNA测序,获得了胸椎黄韧带骨化细胞显著性差异表达的miRNAs谱,共7个;2.本研究预测了差异表达的miRNAs的靶基因,共172个;3.本研究对预测的靶基因进行GO分析,发现它们靶点广泛,涉及到基因表达,细胞分化,转录调控等,部分靶基因已被发现具有促进成骨分化的作用;4.本研究通过KEGG分析,发现多个重要的成骨相关性信号通路（Notch信号通路、Wnt信号通路、TGF-β信号通路、PI3K/Akt信号通路等）可能参与TOLF的成骨过程。