霍乱毒素诱导的恶性胶质瘤细胞分化及机制研究

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目前,对于恶性和复发的胶质瘤患者仍没有有效的治疗手段,虽然采取手术切除、放疗和化疗的治疗方法,但是瘤患者的预后并不乐观,诱导分化疗法被认为是种很有前景的胶质瘤治疗方法。诱导分化是指恶性肿瘤细胞在体内外诱导分化剂的作用下,重新分化,向正常成熟细胞方向逆转的现象,它是一种“细胞改造”过程,对正常细胞不产生毒副反应。寻找高效低毒的诱导分化剂是这一策略的核心。 霍乱毒素(Cholera toxin)是已知的G蛋白激动剂,迅速提高细胞内环腺苷酸(cAMP)水平。cAMP具有抑制细胞增殖和促进分化的作用。从不同途径上调cAMP,均可抑制胶质瘤细胞增殖,诱导其分化和凋亡。Cholera toxin作为一种生物毒素,在肿瘤诱导分化治疗领域显示了一定的潜能。 本研究拟对经Cholera toxin处理过的胶质瘤大鼠C6细胞株及原代培养的人胶质瘤细胞进行检测,观察Cholera toxin对C胶质瘤细胞的生长和分化以及细胞周期调节蛋白表达的影响,验证Cholera toxin对胶质瘤细胞的诱导分化作用,分析Cholera toxin抗肿瘤作用的可能机制;初步研究PKA/CREB及PI3K/Akt/GSK-3β介导的cyclin D1泛素化降解在Cholera toxin诱导的胶质瘤细胞分化中的作用,为临床有效治疗恶性胶质瘤提供新的思路。 第一章霍乱毒素对神经胶质瘤细胞的诱导分化作用。 方法: 大鼠C6细胞株培养及原代人恶性胶质瘤细胞的分离和培养;相差显微镜及透射电镜观察Choleratoxin作用前后的形态及细胞内部超微结构;Western blotting蛋白免疫印迹法分别检测胶质纤维酸性蚩白(GFAP)、Ki67蚩白水平;免疫组化及免疫荧光染色方法检测GFAP表达:甲基偶氮唑蓝比色(3-(4,5-dimethylthiazol-2-y1)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT)法测定细胞增殖能力;Hoechst33258染色观察核及染色质的形态变化;乳酸脱氢酶(LDH)漏出率检测测定细胞存活率;流式细胞仪检测细胞周期; westem blotting检测周期调控蛋白cyclin D1、CDK2、CDK4、Rb、p21、p27活性的变化,探讨周期调控蛋白在Cholera toxin诱导的胶质瘤细胞分化中的作用机制;定量实验结果以x±s表示,采用t检验和方差分析。 结论: Cholera toxin可诱导胶质瘤细胞分化,该作用可能与周期调控蛋白cyclin D1、CDK2、CDK4、Rb下调,p21上调有关。 第二章 PKA/CREB通路参与霍乱毒素诱导的胶质瘤细胞分化。 方法: 大鼠C6细胞株培养;相差显微镜术观察细胞胞体及突起形态;蛋白激酶A(PKA)激酶活性测定;siCREB转染细胞并检测转染率;Westernblotting蛋白免疫印迹法分别检NGFAP、cyclin D1、cAMP应答元件结合蛋白(CREB)及其磷酸化蛋白水平。 结论: PKA/CREB通路参与Cholera toxin诱导的C6胶质瘤细胞分化,且PKA/CREB激活是这种分化过程中不可缺少的重要因素。 第三章依赖GSK-3p的cyclin D1泛素化降解是霍乱毒素诱导的胶质瘤细胞分化必需的。 方法: 大鼠C6细胞株培养;相差显微镜术观察细胞胞体及突起形态;Western blotting蛋白免疫印迹法分别检测GFAP、cyclin D1、蚩白激酶B(PKB)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)及其磷酸化蛋白水平;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)观察GFAP、cyclinD1基因的表达水平;流式细胞仪(flow cytometry)检测细胞周期。 结论: Cholera toxin引起的cyclin D1泛素-蛋白酶体降解依赖P13K/Akt/GSK-3β通路。且GSK-3β激活也是Cholera toxin诱导的C6细胞分化必需的。 第四章基因芯片分析霍乱毒素诱导的胶质瘤细胞诱导分化表达谱。 方法:从Cholera toxin诱导前、诱导后1h两个样晶总RNA中分离得到了足够的mRNA,标记为探针,进行cDNA array。 结论: 生物信息学是分析基因表达谱的有力工具,本文初步建立了 Cholera toxin诱导分化相关基因表达谱。并筛选出了胶质瘤分化相关的关键基因供进一步研究。 第五章中药柴胡提取物对嗜铬细胞瘤细胞的诱导分化作用。 方法: 柴胡根部粉碎物溶剂提取;嗜铬细胞瘤(PC12)细胞分化活性观察;层析分离得活性化合物,MTT法检测其对PC12增殖的影响。 结论: 以PC12诱导分化活性指导活性成份分离是一种方便快捷的筛选方法。6’-O-乙酰柴胡皂甙a是一种有效的PC12细胞诱导分化剂。
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