背景胰腺癌是预后极差的几种消化道肿瘤之一,近年来,在世界范围包括我国其发病率及病死率呈现逐年上升的趋势。胰腺癌是高侵袭性恶性肿瘤,它通常表现为高转移性及不能完全切除性,手术可切除率低于10%-20%^[1-2],且术后复发率高。它的主要治疗手段包括手术、化疗和放射治疗。尽管这些年来在外科技术、化疗和放疗方案方面取得了新的进展,但由于可手术率低,对放化疗敏感度较差,在治疗中如何合理的选择敏感度高的化疗药物至关重要。SOX8是SOX基因家族的一员,该基因家族编码产物为转录调节因子,并且编码产物在决定性别决定及胚胎发育和过程中起着及其重要的作用,有越来越多研究证明,SOX8基因的表达异常与肿瘤的发生发展有密切的联系。因此,我们通过探讨SOX8在胰腺导管腺癌的表达变化及其变化对胰腺癌治疗的意义,我们设计了本项研究课题。方法1.收集临床行胰腺导管腺癌手术治疗后的有明确病理诊断的肿瘤组织石蜡标本,选取3种不同公司不同克隆号的SOX8抗体,进行免疫组化染色分析,判断SOX8蛋白在胰腺导管腺癌肿瘤组织的分布及表达情况,并进行统计处理;结合相关的临床资料,分析SOX8的表达水平与上述胰腺恶性肿瘤患者各项临床指标、病理指标及药物处理后的不同反应之间的关系;进一步分析上述患者接受含有白蛋白结合型紫杉醇方案化疗的敏感度,并进行定期的规律复查以及随访进一步进行生存分析。2.构建SOX8过表达稳转胰腺癌细胞系与降表达稳转胰腺癌细胞系以及SOX8过表达质粒和干扰RNA;分别在蛋白及mRNA水平验证稳系及瞬时转染效果。观察不同SOX8水平表达的胰腺导管腺癌细胞株在接受白蛋白结合型紫杉醇药物处理后的不同耐受反应,分别用Western Blot及免疫荧光观察过表达、降表达或干扰SOX8后的不同细胞微管蛋白的解聚变化,用流式细胞术进一步分析上述细胞系周期的变化情况,根据细胞周期变化情况,通过Western Blot观察β-catenin与SOX8之间的调控关系。并用TCGA数据库进一步分析两者之间关系。3.根据相关研究结果及TCGA数据库分析EZH2与β-catenin之间存在正向调节关系,通过应用启动子区结合阵列分析,确定EZH2为接受SOX8转录调控的作,用Western blot验证EZH2与β-catenin的表达水平。应用染色质免疫沉淀技术（ChIP,Chromatin Immunoprecipitation Assay）及双荧光素酶技术进一步明确胰腺癌细胞SOX8对EZH2的直接转录调控的作用。通过核浆分离实验分别提取胰腺癌细胞核及细胞浆蛋白,Western Blot检测SOX8过表达和降表达后EZH2、β-catenin的变化情况,并通过免疫荧光实验观察SOX8过表达和降表达胰腺癌细胞系接受白蛋白结合型紫杉醇处理后的细胞微管蛋白的变化,进一步验证各指标之间是否存在相关性。最后通过相应的阻断回复实验进一步确定SOX8、EZH2、β-catenin三者之间的调控关系,研究SOX8影响胰腺癌细胞系对白蛋白结合型紫杉醇治疗敏感度的可能机制。4.使用SOX8表达不同的人胰腺癌肿瘤原代细胞构建胰腺癌皮下成瘤的裸鼠模型,通过腹腔注射白蛋白结合型紫杉醇以及EZH2抑制剂,评估SOX8对接受白蛋白结合型紫杉醇治疗后的药物反应的关系。结果1.SOX8在胰腺导管腺癌肿瘤组织及癌旁组织中的表达情况及相关的临床意义。通过对117例胰腺导管腺癌手术标本切片进行免疫组化染色,发现SOX8在肿瘤组织中表达存在一定差异,根据SOX8的免疫组织化学检验的表达情况将相应临床资料分为两个亚组,SOX8高表达组及SOX8低表达组。通过Kaplan-Meier曲线分析发现SOX8升高患者预后明显较差（DFS 12.6月vs6.6月,P<0.05）。该数据与TCGA数据库结果一致。进一步分析117例胰腺导管腺癌接受手术治疗的患者的临床数据资料,SOX8低表达的有36例（30.8%）,SOX8中高表达的有81例（69.2%）;通过临床资料进行数据分析SOX8蛋白表达水平与各病理参数的关系,我们发现胰腺癌病理切片SOX8高表达的患者较SOX8低表达的更容易存在淋巴结转移、肿瘤体积更大;2.胰腺导管腺癌细胞SOX8蛋白表达水平与接受白蛋白结合型紫杉醇处理后的细胞凋亡及细胞周期变化存在一定的关系。根据胰癌细胞系不同的SOX8的基础表达水平,采用慢病毒感染技术构建成功了SOX8过表达的胰腺导管腺癌细胞系（CFPAC-1和PANC-1）和SOX8降表达的细胞系（CFPAC-1和MIAPaCa-2）。SOX8高表达的胰腺癌细胞较低表达的胰腺癌细胞接受白蛋白紫杉醇处理后细胞凋亡减少,且细胞微管蛋白集聚现象减弱。胰腺导管腺癌细胞SOX8蛋白表达水平与β-catenin表达水平呈显著正相关关系（R=0.301,**p<0.01）。SOX8过表达的胰腺腺管腺癌β-catenin及其下游的与细胞周期相关的蛋白:细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、C-myc较野生对照组升高。且在胰腺癌肿瘤组织连续石蜡切片共定位实验证实SOX8与β-catenin的表达存在一致性,流式细胞术检验证实SOX8低表达的胰腺癌细胞接受白蛋白结合型紫杉醇处理后更多的集聚于G2期,而SOX8过表达的胰腺癌细胞接受白蛋白结合型紫杉醇处理后集聚G2期的细胞比例较SOX8低表达的胰腺癌细胞减少。且在SOX8低表达胰腺癌细胞系中上调β-catenin后发现集聚G2期细胞比例较SOX8低表达的胰腺癌细胞减少。3.SOX8蛋白作为转录调控因子直接参与了胰腺导管腺癌细胞EZH2的表达调控。应用Western Blot和实时定量PCR检验不同稳转细胞系SOX8以及EZH2在蛋白水平和mRNA水平表达的变化。结果显示胰腺导管癌细胞EZH2的表达水平受肿瘤细胞SOX8的直接调控,呈显著正相关关系。生物细胞信息学分析提示EZH2启动子区存在SOX8转录调控结合的潜在序列,应用ChIP（染色质免疫共沉淀）技术,证实了存在转录调控因子SOX8与EZH2启动子区域的结合位点;进而构建EZH2启动子区域报告基因的载体,双荧光素酶报告基因实验验证了SOX8直接结合并且转录激活EZH2的表达,进而转染上述SOX8在EZH2启动子区域结合位点的过表达载体,结合位点1、3的转录活性显著增强,证实了腺癌细胞SOX8可以直接调控EZH2的表达进而调控β-catenin的表达。4.构建人胰腺癌肿瘤原代细胞胰腺癌皮下成瘤的裸鼠模型,通过腹腔注射白蛋白结合型紫杉醇以及EZH2抑制剂,结果提示SOX8高表达的人胰腺癌肿瘤原代细胞胰腺癌皮下成瘤的裸鼠在应用白蛋白结合型紫杉醇治疗后较SOX8低表达组对肿瘤的抑制作用减弱。而给予EZH2抑制剂后对肿瘤抑制作用改善。结论1.SOX8蛋白在胰腺导管腺癌组织中表达存在差异性,SOX8高表达提示胰腺导管腺癌患者的预后不良;2.SOX8表达与肿瘤细胞β-catenin及其下游的与细胞周期相关的蛋白:细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、C-myc表达水平呈现出正向相关的关系,SOX8低表达的胰腺癌细胞接受白蛋白结合型紫杉醇处理后更多的集聚于G2期,SOX8升高提示相对应的肿瘤细胞对白蛋白结合型紫杉醇反应降低。3.SOX8表达与肿瘤细胞EZH2蛋白表达水平存在正向相关关系,EZH2的启动子区域存在SOX8转录调控结合的靶序列,胰腺癌细胞SOX8蛋白可以直接结合到EZH2的启动子区域的特定靶序列,激活EZH2转录,进而上调EZH2及下游β-catenin的表达。4.构建人胰腺癌肿瘤原代细胞胰腺癌皮下成瘤的裸鼠模型给予白蛋白结合型紫杉醇药物治疗后SOX8高表达组对肿瘤的白蛋白结合型紫杉醇抑制作用较低表达组减弱。而给予EZH2抑制剂后对肿瘤抑制作用改善。SOX8可以预测胰腺癌患者对白蛋白结合型紫杉醇的药物治疗效果,有望成为的白蛋白结合型紫杉醇治疗效果的筛选标记。