膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤,其发病率呈逐年上升趋势,具有多发性和易复发等特点,70%-80%为浅表性膀胱癌。据文献报道,经尿道膀胱肿瘤电切术（TURBt）或膀胱部分切除术后2年肿瘤复发率达50%-70%,而且复发的病例中有10%-30%伴有恶性程度增高或浸润能力增强。因此,术后行膀胱灌注药物治疗对于预防肿瘤复发具有重要意义。目前常用膀胱腔内治疗的药物有两类,一类是化疗药物,如丝裂霉素、阿霉素、噻替哌等;另一类是免疫增强剂,如BCG、白介素-2（IL-2）、γ-干扰素（INF-γ）等。化疗药物的副作用较少,但常引起膀胱癌细胞多药耐药基因的激活,高表达P-gp糖蛋白,将抗癌药物泵出细胞外,使化疗药物药效降低,达不到治疗目的,术后复发率高,例如5年复发率噻替哌44%-51%,阿霉素33%-42%,丝裂霉素42%-49%。BCG是应用最早的肿瘤治疗生物制剂,在预防膀胱癌术后复发,防止肿瘤进展作用上有显著疗效,治疗浅表性膀胱癌术后五年复发率仅为18.9%。此外BCG还有治疗作用,对残留小肿瘤有效率为50%-60%,对原位癌的完全有效率为70%- 75%,引起5年以上持久缓解的总有效率平均为70%。将BCG直接灌入上部集合系统,可有效治疗上泌尿道移行细胞癌。BCG膀胱灌注被认为是目前预防浅表性膀胱癌复发最有效的方法,但存在较多的局部和全身副反应,大多数患者出现膀胱炎症状,包括尿频、尿急、尿痛、排尿困难,偶有血尿。此外,还会出现尿道及膀胱肉芽肿等。全身症状如高热、不适和一过性流感样症状亦常见。5%的患者发生严重副反应,常与明显的BCG脓毒病有关,目前已有报道7例患者死于膀胱灌注引起的BCG脓毒病。临床上有的患者常因并发症而不能完成整个治疗疗程。因此,寻找一种具有BCG生物活性而又没有其所带来的副反应的物质来治疗膀胱癌,是当前临床亟待解决的问题。本实验通过对BCG、BCG提取物（BCGE2）和Ag85B的抗小鼠膀胱癌的治疗作用进行分析,旨在寻求治疗膀胱癌的更佳药物,这对膀胱癌的治疗有重要意义。目的:膀胱移行细胞癌是泌尿系统最常见的肿瘤,其复发率高一直是困扰临床医生的严重问题,因此,寻找一种有效的药物来控制肿瘤生长,降低复发率对膀胱癌的治疗至关重要。BCG被认为是目前治疗膀胱癌的最有效的药物,但存在许多不良反应。Ag85B是BCG的重要成分之一,是分枝杆菌最主要的分泌蛋白,能够诱导机体强烈的Th1免疫反应,并在分枝杆菌细胞壁合成中发挥重要作用,还具有与纤维粘连素相结合的特性。该蛋白能够诱导Th1型免疫细胞分泌IL-2、TNF -α和INF -γ等细胞因子。本实验通过检测BCG及其相关成分对免疫细胞产生各种细胞因子的作用,观察抑瘤率和荷瘤小鼠生存期,分析肿瘤细胞坏死和凋亡情况,对BCG、BCGE2及Ag85B对小鼠膀胱移行细胞癌作用效果及机制作初步探讨,旨在为寻求对膀胱癌治疗的更佳药物提供一定的依据。材料与方法1小鼠可移植性膀胱细胞癌动物模型的建立1.1 BTT739膀胱移行细胞癌株由上海市第一人民医院病理科提供,常规培养传代分瓶,培养至对数生长期。T739小鼠由中国医学科学院肿瘤研究所提供,由河北医科大学实验动物中心饲养。1.2 T739近交系小鼠4⁶周龄共48只,体重18²2克,随机平均分为四大组,雌雄各半。每大组平均分为两小组,雌雄各半。每只小鼠右侧腋下皮下注射浓度为5.0×106/ml的BTT739 0.1ml。2药物干预膀胱移行细胞癌的生长各组小鼠分别于接种膀胱癌细胞的第1天、第5天、第9天、第13天和第17天分别在肿瘤结节周围注射生理盐水、BCG、BCGE2及Ag85B。生理盐水组作为对照组,其他组作为治疗组。第18天每大组随机处死1小组,处死组取血离心分离血清并解剖瘤组织称重,根据瘤重计算抑瘤率:抑瘤率（%）=（1-治疗组平均瘤重/生理盐水组平均瘤重）×100%。瘤组织分3部分,分别行病理检查、电镜和流式细胞分析。另1小组观察荷瘤鼠观察生存期,并计算存活延长率。存活延长率（%）=（治疗组平均存活天数/生理盐水组平均存活天数-1）×100%。3双抗体夹心ABC-ELISA法检测生理盐水、BCG、BCGE2及Ag85B处理组的T739荷瘤小鼠血清中IL-2、TNF-α与IFN-γ浓度3.1检测各组小鼠的IL-2的浓度按照EIA试剂盒使用说明建立标准曲线。于48孔培养板中,每孔加入待检样品100μl-混匀,放置37℃120分钟,洗板后加入第一抗体工作液50μl,放置37℃60分钟,加入酶标抗体工作液100μl,置37℃60分钟,洗板加入底物工作液100μl,置37℃暗处10分钟后加入1滴终止液混匀,492nm处测吸光值。根据吸光值在标准曲线上查出相应IL-2的含量。3.2检测各组小鼠血清中TNF-α和IFN-γ浓度（同3.1）4流式细胞术检测4.1检测肿瘤细胞的增殖将经70%酒精固定的膀胱移行细胞癌组织制成单细胞悬液。用溴化乙锭（EB）染液进行DNA定量荧光染色,流式细胞术进行分析。应用DNA细胞周期分析软件,计算DNA组方图G0/1、S、G2M的百分比,以细胞增殖指数（proliferation index, PI）表示细胞的增殖活性。计算公式为:P（I%）=（S+G2M）（/G0/1+S+G2M）×100%。4.2检测细胞凋亡情况（凋亡百分比）各细胞样品经染色过滤后,单细胞悬液用流式细胞仪检测。5光镜及透射电镜下观察各组肿瘤细胞的坏死及凋亡情况结果1.1处死小鼠解剖瘤组织称重,生理盐水组、BCG组、BCGE2组及Ag85B组T739瘤小鼠的平均瘤重分别为（6.67±1.54）g、（ 4.24±1.19）g、（ 3.90±1.58）g和（ 2.80±1.05 ）g。后三组平均抑瘤率分别为36.43%、41.52%和58.02%。生理盐水组荷瘤小鼠平均瘤重明显高于其余三组,差别有显著性;Ag85B处理组荷瘤小鼠平均瘤重明显低于其它两组,其差别有显著性。其余两组之间无差别。1.2生理盐水、BCG、BCGE2及Ag85B处理后各组小鼠的平均生存期分别为18.58±1.83天、24.42±5.51天、25.12±4.64天和30.25±5.43天。生理盐水组荷瘤小鼠平均生存期明显低于其余三组,差别有显著性;其余三组中Ag85B组明显长于其余两组,差别有显著性,余两组之间无差别。各治疗组荷瘤小鼠存活延长率依次为31.43%、35.20%和62.81%。2.1 ELISA法检测各组小鼠血清的IL-2浓度生理盐水组IL-2浓度明显低于其他三组,差别有显著性,Ag85B组IL-2明显高于其他三组,差别有显著性,BCG组、BCGE2组之间无统计学差别。2.2各组小鼠血清的TNF-α和IFN-γ含量生理盐水组明显低于其余三组,差别有显著性,其余三组中Ag85B组TNF-α和IFN-γ含量明显高于其它两组,差别有显著性,BCG组与BCGE₂组之间统计学上无差别。3.1不同处理组荷瘤小鼠肿瘤细胞的增值情况生理盐水组、BCG组、BCGE2组及Ag85B组肿瘤细胞平均增殖指数分别为（36.95±6.30）%、（ 29.65±3.48）%、（ 28.73±2.38）%和（21.40±2.00）%。生理盐水组平均增殖指数明显高于其它组,差别有显著性,其余三组中Ag85B组明显低于其它两组,在统计学上差别有显著性。BCG组与BCGE2组之间统计学上无差别。3.2不同处理组荷瘤小鼠肿瘤细胞的流式细胞术检测生理盐水组、BCG组、BCGE2组及Ag85B组荷瘤小鼠组肿瘤细胞平均凋亡率分别为（21.67±1.22）%、（24.78±1.75）%、（25.28±2.53）%和（26.18±3.39）%。四组之间无统计学差别。但与空白对照组比较,治疗组中肿瘤细胞凋亡率均有增加趋势,Ag85B组最高。4光镜和透射电镜下观察肿瘤细胞的变化生理盐水组瘤细胞有点状坏死;BCG组有点片状坏死;BCGE₂组有小片状坏死;Ag85B组大片状坏死。生理盐水组、BCG组、BCGE₂组与Ag85B组均有散在的凋亡细胞。结论1 BCG、BCGE₂及Ag85B均能够明显抑制肿瘤生长,延长荷瘤鼠生存期,其中Ag85B的效果最好。2 BCG、BCGE₂及Ag85B均能使荷瘤鼠血清IL-2、TNF-α与IFN-γ浓度升高。其中Ag85B对小鼠细胞因子的诱导水平要高于其他两种物质,这可能由于该物质经高度纯化去除了其他物质的干扰。IL-2、TNF-α、IFN-γ等细胞因子浓度的提高可能是该三种物质治疗膀胱移行细胞癌的重要环节之一。3各治疗组细胞增殖受到明显抑制,低于对照组,Ag85B抑制效果最好。上述结果可能也是因为Ag85B相对高度纯化,而其他两种物质成分复杂相互影响干扰了总体效果;治疗组瘤细胞的凋亡百分比与对照组相比无明显差别,仅有增加趋势,Ag85B组较高。推测三种物质作用于肿瘤细胞以坏死为主,凋亡不占主导地位。光镜和透射电镜下的观察结果与上述推测一致。4 BCG、BCGE₂及Ag85B通过不完全相同的分子生物学机制发挥作用。BCG含有多种抗原成分,各自发挥不同的作用,这可能是其治疗膀胱肿瘤不良反应的重要原因。提取物质如果不高度纯化,其中某些成分可能通过多种途径而影响其各种指标。Ag85B经高度纯化和提取,能更有效提高机体的免疫能力,用于治疗膀胱移行细胞癌可能减少不良反应,在临床上使用更安全,更有效抑制肿瘤生长同时降低肿瘤复发率。