【摘 要】
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动脉粥样硬化斑块的突然破裂是引起急性心脑血管疾病的重要病理基础。患者可长期无临床症状,一旦斑块破裂则会导致心肌梗死或脑卒中,是这类患者死亡的主要原因。对斑块的准确检测是避免这类情况发生的有效手段。分子影像学手段因其高度特异性能有效对疾病状态进行成像,通过选择合适的分子靶点,可以监测斑块进展,指导治疗。组织因子（Tissue factor,TF）是影响动脉粥样硬化进展和血栓形成的关键因子,因而可以作
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动脉粥样硬化斑块的突然破裂是引起急性心脑血管疾病的重要病理基础。患者可长期无临床症状,一旦斑块破裂则会导致心肌梗死或脑卒中,是这类患者死亡的主要原因。对斑块的准确检测是避免这类情况发生的有效手段。分子影像学手段因其高度特异性能有效对疾病状态进行成像,通过选择合适的分子靶点,可以监测斑块进展,指导治疗。组织因子（Tissue factor,TF）是影响动脉粥样硬化进展和血栓形成的关键因子,因而可以作为检测动脉粥样斑块的一个潜在靶点。本研究构建了具有组织因子靶向性的磁性纳米探针,研究其作为造影剂对动脉粥样斑块的成像效果,实现对动脉粥样斑块的分子影像学诊断。此外,TF活化可由“静密型”变成“解密型”。活化的TF作为凝血途径与炎症反应中的共同因子,其作用贯穿于粥样斑块发展和不稳定斑块的形成,是早期发现易损斑块的理想靶标,通过准确定量具有活性的TF可以预警易损斑块,实现更精确的分子诊断。本研究分为五章。第一章将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标记的EGF1融合蛋白（EGFP-EGF1）和超顺磁性氧化铁纳米粒（SPIONs）通过缩合反应成功构建了EGFP-EGF1-SPIONs纳米探针。理化性质表征证明EGFP-EGF1-SPIONs具有稳定性好,良好的生物相容性等特点,其大小可以满足作为造影剂在血液循环中穿行。同时,计算了EGFP-EGF1-SPIONs的弛豫率r2,为357.0 m M-1s-1,与SPIONs相比,有更高的弛豫率、更好的负性对比增强效果,可进一步研究作为分子影像学的磁共振造影剂。第二章验证了EGFP-EGF1-SPIONs的生物安全性和特异性靶向TF的能力。CCK-8检测EGFP-EGF1-SPIONs在安全剂量内不影响细胞活性,不具有生物毒性。体外实验中,通过LPS刺激小鼠主动脉内皮细胞（MAECs）形成高表达TF的体外模型,免疫荧光显示EGFP-EGF1-SPIONs可特异性地与高表达TF的细胞大量结合;且在用TF-si RNA干扰细胞TF表达减少后,EGFP-EGF1-SPIONs与细胞的结合也相应地显著减少,进一步说明EGFP-EGF1-SPIONs可以特异性的结合TF,靶向高表达TF的细胞、组织或器官,具有良好的特异性和专一性。第三章证明了EGFP-EGF1-SPIONs作为磁共振造影剂对动脉粥样硬化模型小鼠斑块进行体内成像的效果。首先建立了动脉粥样硬化小鼠模型,免疫组化证明斑块处有TF高表达,且TF表达量与斑块不稳定性成正相关;同时,斑块越进展,TF表达越多。随后,小鼠体内磁共振成像表明注射EGFP-EGF1-SPIONs后,斑块局部信号明显减低,且普鲁士蓝染色证明斑块处有EGFP-EGF1-SPIONs纳米粒沉积,与影像学表现一致。说明EGFP-EGF1-SPIONs能特异地靶向动脉粥样斑块是因为其在斑块处特异性聚集。因此,EGEP-EGF1-SPIONs可以有效地靶向动脉粥样硬化斑块并有明显MRI T2增强效果,可以作为检测动脉粥样斑块的分子探针。第四章我们以TF上aa248-259为配体结合表位,通过GLIDE程序进一步设计筛选靶向“解密型”TF的最佳构象敏感性的EGF1衍生多肽E1、E2。通过表面等离子共振技术检测其与TF的亲和力大小,显示E1与TF的亲和力显著高于EGF1,为后一步构建对易损斑块更敏感的探针做准备。第五章将EGF1、E1、E2与SPIONs偶联构建EGF1-SPIONs、E1-SPIONs和E2-SPIONs纳米探针。E1-SPIONs和E2-SPIONs相比EGF1-SPIONs的有更高的弛豫率,有更好的负性对比增强效果。因此E1-SPIONs和E2-SPIONs可以作为敏感的磁共振造影剂,其更进一步的体外和体内研究待后续进行。综上所述,和一般的造影剂相比,EGFP-EGF1-SPIONs在对Apo E-/-动脉粥样模型小鼠斑块的体内磁共振成像中表现出了更高的精确度、更好的组织相容性、更强的特异行以及更卓越的对比效应。它可以作为一种理想的磁共振造影剂,用于对斑块特异性分子影像学评价从而为斑块的早期诊断和治疗提供新的可能性。同时,通过进一步筛选构想敏感性衍生多肽,从而对探针靶头进一步优化,为实现更精确的分子影像学诊断研究做准备。
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