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甘丙肽广泛分布于中枢和外周神经系统,并通过其同属于G蛋白偶联受体(GPCR)的三个亚型受体(GalR1、GalR2、GalR3)参与多种神经生理功能。其中甘丙肽2型受体(GalR2)功能的信号及转运机制目前尚不是很清楚。对于GPCRs家族其大多数受体的羧基端对受体转运及信号转导发挥着十分重要的作用。本工作通过寻找与人GalR2(hGalR2)羧基端相互作用的蛋白,以便进一步探讨GalR2转运及下游信号转导机制,并验证了筛选出的相互作用蛋白之一Cysteine-richPDZ-bindingprotein(CRIPT)对GalR2膜转运的影响。
本实验第一部分应用Clontech公司的第三代酵母双杂交系统MatchmakerTMGal4Two-HybridSystem3筛选并验证出可以与hGalR2羧基端发生相互作用的蛋白41个。其中未知蛋白14个,已知蛋白27个。已知蛋白可以分为10大类:①支架蛋白、②DNA结合蛋白、③mRNA编辑剪接、④泛素化相关、⑤对氨基酸进行修饰、⑥蛋白转运、⑦蛋白磷酸化修饰、⑧氧化应激、⑨金属酶抑制剂、⑩转运体相关。
实验第二部分是初步研究筛选出的蛋白CRIPT与hGalR2的相互作用。CRIPT是一个由101个氨基酸构成的胞浆蛋白,其末尾PDZ-配体结构域的特点使其可与含有PDZ结构域的蛋白发生相互作用。CRIPT可以与微管蛋白发生相互作用,并可以调节一些蛋白在细胞中的分布及转运。应用免疫共沉淀技术验证CRIPT与hGalR2确实可以发生相互作用。利用siRNA技术敲减HEK293A细胞的内源性CRIPT后,用免疫组化检测其对于GalR2的分布有无影响。发现将CRIPT成功干扰后甘丙肽刺激引起的hGalR2内化明显减少,提示CRIPT可能可以通过与hGalR2的羧基端相互作用而影响该受体膜转运的内化过程。