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近年来以CRISPR/Cas9为基础的基因编辑技术发展迅速,其广泛应用于细胞模型和活体转基因模型的建立。研究者大多采用靶位点sgRNA联合Cas9蛋白显微注射到动物胚胎实现活体水平目的基因的编辑。为探讨能否利用CRISPR/Cas9实现动物体肌肉组织特异的基因编辑,本研究利用Rosa26基因的广谱性表达,在此基因位置发生序列变化不影响其他基因功能的特性,将Cas9基因连接到人工合成的肌肉特异表达启动子(SP启动子)下游,在C2C12(骨骼肌细胞的前体细胞)中检测该系统的编辑效率,在此基础上构建Rosa26位点的同源重组载体,该载体可以整合到C2C12细胞和小鼠胚胎,为肌肉组织特异的基因编辑研究奠定基础。具体情况如下:1.PX459-Rosa26-SP-DsRed示踪载体的构建将实验室前期工作中构建PX459-Rosa26(该载体带有针对Rosa26位点的sgRNA片段)的CMV启动子替换为肌肉特异启动子SP,构建PX459-Rosa26-SP载体。XbaI酶切未切开显示打靶后C2C12细胞的XbaI位点破坏,T7E1切开显示发生切割并NHEJ修复,该载体成功打靶Rosa26基因位点,并实现组织特异性表达。将该载体加上红色荧光,构建组织特异性表达Cas9示踪打靶载体PX459-Rosa26-SP-DsRed,以便于观察和后续实验进行。2.Donor-SP-Cas9-DsRed载体构建和整合检测为实现Rosa26位点的同源打靶,本研究将构建的PX459-Rosa26-SP-DsRed载体上的SP-Cas9-T2A-DsRed片段扩增与DC-DON-SH02 Rosa26载体酶切片段用重组酶连接构建Donor-SP-Cas9-DsRed同源打靶载体。该载体与PX459-Rosa26-SP载体共转染C2C12细胞,抗性筛选后提取细胞基因组,PCR结果表明同源打靶载体整合进C2C12细胞基因序列内,可以用于后续胚胎编辑研究。3.Rosa26位点敲除胚胎的获得本研究针对Rosa26位点设计sgRNA并联合Cas9蛋白进行胚胎注射,获得Rosa26基因编辑胚。对574个原核时期的受精卵显微注射,217个发育至二细胞,卵裂率为66.7%,有103个胚胎发育到囊胚,囊胚率为41.7%,收集8个囊胚提取DNA,部分PCR产物可被T7E1酶完全切开。将打靶位置扩增回收送测序,比对测序位置发生编辑情况,结果显示1 8.3%的胚胎发生了基因敲除。4.同源重组载体敲入胚胎效率为了实现在肌肉中特异表达Cas9蛋白,本研究应用Donor-SP-Cas9-DsRed同源打靶载体联合Rosa26 sgRNA及Cas9蛋白注射小鼠原核期胚胎。将493个原核时期的胚胎显微注射,第二天观察到254个2细胞胚胎,卵裂率为69.59%,有194个发育至囊胚阶段的胚胎,囊胚率为76.38%。收集囊胚提取DNA,使用鉴定引物PCR鉴定同源重组载体的插入情况,发现有3个胚胎扩增出1248bp的目的条带,同源打靶载体打靶胚胎的编辑效率为29.38%。