【摘 要】
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莱氏绿僵菌（Metarhizium rileyi）是一种全世界范围内广泛分布的昆虫病原真菌,在害虫生物防治方面具有较大应用潜力。该菌以分生孢子粘附在宿主昆虫体表,萌发后通过机械压力和分泌表皮降解酶等方式穿透昆虫体壁,在宿主血腔内能逃避或抑制宿主的免疫反应,从而在昆虫体内以酵母状态的芽生孢子大量繁殖,完全占领昆虫血腔使其僵硬而死。草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）是我国近年来的
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莱氏绿僵菌（Metarhizium rileyi）是一种全世界范围内广泛分布的昆虫病原真菌,在害虫生物防治方面具有较大应用潜力。该菌以分生孢子粘附在宿主昆虫体表,萌发后通过机械压力和分泌表皮降解酶等方式穿透昆虫体壁,在宿主血腔内能逃避或抑制宿主的免疫反应,从而在昆虫体内以酵母状态的芽生孢子大量繁殖,完全占领昆虫血腔使其僵硬而死。草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）是我国近年来的外来入侵物种,危害较严重,防控难度大。现有研究发现莱氏绿僵菌对草地贪夜蛾有很强的毒力,但其具体的致病机制仍然不清楚,因此本项研究中我们用课题组的莱氏绿僵菌Nr06菌株感染草地贪夜蛾幼虫,对其抵御草地贪夜蛾先天免疫反应及宿主免疫应答的机理进行研究,具体结果如下:1、毒力测定用分生孢子感染草地贪夜蛾3龄幼虫,结果表明,在感染后第10 d,1×109个/mL和1×108个/mL感染浓度下存活率分别为0和10%,1×107个/mL和1×106个/mL浓度下存活率分别为40%和70%,可见莱氏绿僵菌Nr06菌株对草地贪夜蛾有较强的杀虫活性。2、注射感染浓度的确定设置3个芽生孢子浓度梯度,注射感染草地贪夜蛾6龄幼虫,根据结果选择1 × 104个孢子/虫这一感染强度来进行后续实验。3、对细胞免疫反应的影响在感染真菌后,草地贪夜蛾血细胞的总数显著减少,粒细胞和浆细胞总数也显著降低;血细胞的结节、包囊、吞噬反应能力受到显著的抑制;浆细胞的延展能力被显著抑制。4、对血细胞细胞骨架的影响利用FITC标记的鬼笔环肽对血细胞的细胞骨架进行染色,结果显示真菌感染后血细胞的细胞骨架发生紊乱,细胞的正常结构受到破坏。这一结果表明莱氏绿僵菌可能通过破坏血细胞的细胞骨架来影响血细胞的延展能力,从而全面抑制草地贪夜蛾的各种细胞免疫反应。5、对体液免疫反应的影响在感染真菌后,草地贪夜蛾的酚氧化酶原激活反应没有受到影响;抑菌试验结果显示,感染真菌后,草地贪夜蛾的血淋巴对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有明显的抑菌活性。6、脂肪体转录组分析与验证为了进一步深入探究草地贪夜蛾对莱氏绿僵菌的免疫应答机制,我们取感染和未感染真菌的草地贪夜蛾脂肪体,进行转录组测序。转录组共鉴定到1771个差异表达基因,其中12h样本中,上调基因468个,下调基因325个;48h样本中,上调表达基因574个,下调表达基因484个。这些基因参与了多个生物学过程,从中筛选出与昆虫先天免疫相关基因共134个,包括模式识别受体32个;Toll、Imd、JAK/STAT信号通路相关因子23个;抗菌肽基因及其他效应分子27个;酚氧化酶原激活级联通路相关基因53个。从这些先天免疫基因中挑选出18个差异表达基因,对它们在mRNA水平上的表达量进行了检测验证,qPCR结果与转录组测序结果一致。综上所述,莱氏绿僵菌侵染草地贪夜蛾幼虫后,虽然宿主昆虫能对真菌做出免疫应答,但真菌也能抑制草地贪夜蛾的先天免疫反应。这些结果加深了我们对于昆虫病原真菌与宿主昆虫免疫互作机制的了解,并为将来利用莱氏绿僵菌对草地贪夜蛾进行生物防治提供了理论依据。
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