运用寡核苷酸芯片鉴定检测食源性致病菌技术的研究

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致病菌污染食品可导致多种疾病的暴发与流行,严重威胁人类的健康。因此,若想有效控制食品细菌性疾病的发生,快速而准确地检测食品中致病菌是关键的技术基础之一。传统的细菌培养方法及生化鉴定,操作繁琐,且需要数天才能得到结果。免疫学方法和探针杂交技术也存在特异性或敏感性的问题。常规PCR一次只能检出一种致病菌,对食品中分离的未知菌,或有多种细菌污染的样品则显得无从下手。为了实现对食品中致病菌的快速检测与鉴定,预防肠道细菌性疾病的发生,我们运用寡核苷酸芯片技术建立了对常见食源性致病菌进行检测的方法,检测的目的菌株是霍乱弧菌、肠出血性大肠杆菌0157:H7、副溶血性弧菌、耶尔森氏菌、单增李氏菌、富氏志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、空肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌。我们利用在细菌分类学上具有重要意义的16SrRNA和23S rRNA基因作为检测的靶分子,并在其间设计探针,建立一套食品致病菌的基因芯片快速检测技术。不同细菌的16SrRNA和23SrRNA基因具有序列一致的恒定区和序列不同的可变区,恒定区和可变区交错排列。这样,我们在恒定区设计PCR引物,在可变区设计检测探针;用四对引物在同一反应条件下就可以将全部九种致病菌的相应基因片段扩增出来,再用每种细菌的特异性探针阵列与标记的靶片段进行杂交反应,杂交后用专用设备读取分析荧光信号,可以定性和半定量地检出致病菌。通过杂交结果可以看出设计的探针特异性强,并且相对于传统的方法操作简单、用时少,稳定性、重复性都非常好,灵敏度可达到1.6×10~3cfu/mL,另外,我们还对单独DNA模极下多重PCR扩增反应条件进行了摸索。上述实验结果表明运用寡核苷酸芯片技术所建立的检测方法准确、可靠、实用性强,是检测食品中常见致病菌技术的一次飞跃,并且可一次实验操作同时检测多种食源性致病菌。本文所建立的检测方法为今后在食源性致病菌检测、鉴定领域开展进一步的研究和更大规模的使用奠定了可靠的理论与技术基础。
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