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大肠癌（结直肠癌）是目前最为常见的恶性肿瘤之一，据GLOBOCAN2008数据显示，全球范围内在男性和女性人群中，大肠癌发病率和致死率均排名第三。随着我国经济的发展，人们膳食结构中高脂肪、高糖食物比重增高，并且环境污染加重，都致使大肠癌发病率有升高的趋势。大肠癌发展初期是可以治愈的，然而如果发展至全身扩散的高级阶段，目前没有较好的治愈方法，因此在大肠癌发病早期进行化学药物预防干涉，是目前相对较好的一种策略。非甾体抗炎药（NSAIDs）在大肠癌化学预防方面的作用已经有大量临床和流行病学试验数据支持，是目前非常有应用前景的癌症早期干预措施。托芬那酸是一种广泛用于人类和其他物种的NSAIDs，与同类药物相比抗炎作用强且毒性低。由于近年来在大肠癌等各种肿瘤模型上的研究发现其具有潜在的癌症预防和治疗效果，从而受到更多关注。周期素D1作为一种细胞周期循环的关键调节因子，其异常表达经常与癌症包括大肠癌的发生发展密切相关。本文从托芬那酸对周期素D1蛋白表达的作用开始研究，着重阐明托芬那酸对该蛋白表达调控的分子机理及所涉及的细胞信号通路，并揭示了这些作用机理与癌细胞生长抑制之间的内在联系，主要得到了如下研究结果：1.在癌细胞中分析托芬那酸对周期素D1表达的调控作用，结果显示：周期素D1在大肠癌细胞和肿瘤组织中都存在超表达的现象，托芬那酸可以有效降低各种癌细胞以及小鼠肠道肿瘤组织中周期素D1的表达；在同等剂量条件下，与其他常用NSAIDs相比，托芬那酸对周期素D1表达的抑制作用更好，与常用于治疗结直肠息肉的药物——舒林酸的效果相当。相应的，托芬那酸显著抑制了大肠癌细胞中视网膜细胞瘤蛋白磷酸化（P<0.05），并呈时间依赖效应，而周期素D1表达下调部分参与了此作用。另外，托芬那酸（50μM）处理24h，显著增加了HCT116细胞G2-M期阻滞（P<0.01），从而抑制了细胞生长。2.通过分析托芬那酸对周期素D1基因转录和蛋白稳定性的影响，研究托芬那酸调节周期素D1表达的分子机理，结果显示：托芬那酸处理细胞1h，并不影响转录水平上周期素D1基因的表达（P>0.05），然而24h处理后周期素D1mRNA表达水平会降低。进一步分析发现，托芬那酸处理细胞24h后可以抑制调控周期素D1基因表达的相关转录因子的表达（如β-catenin, Sp-1等），从而降低其启动子活性（P<0.01），这可能是其转录下调的直接原因。添加放线菌酮（CHX，10μg/mL）后，与对照组相比，托芬那酸处理组的周期素D1蛋白水平下降速率没有明显改变，说明其没有影响周期素D1蛋白稳定性。添加不同蛋白降解信号通路抑制剂后，托芬那酸依然显著下调周期素D1表达；托芬那酸没有增加周期素D1蛋白苏氨酸286位点的磷酸化水平，也没有促进其泛素化水平增加。以上研究表明托芬那酸迅速下调周期素D1表达不是发生在转录和翻译后调控阶段，间接证明是通过影响蛋白翻译进程而实现的。3.研究托芬那酸对mTOR介导的蛋白合成调控信号通路的影响，结果显示：添加托芬那酸后， mTOR信号通路上游正调控因子—Akt蛋白激酶激活（丝氨酸473位点磷酸化增加）和负调控因子—GSK-3β蛋白激酶失活（丝氨酸9位点磷酸化增加），同时其下游效应分子p70S6蛋白激酶苏氨酸389位点和S6蛋白丝氨酸235/236位点的磷酸化水平分别得到了显著提高（P<0.01），因此托芬那酸可能激活了mTOR介导的信号通路。此结果与周期素D1蛋白翻译抑制相矛盾，说明其他细胞信号通路参与介导托芬那酸对周期素D1表达下调的作用。4.分析了托芬那酸对内质网（ER）应激反应信号通路的影响及其与周期素D1下调之间的关系。结果显示：在两种大肠癌细胞——HCT116和SW480中，添加托芬那酸可以显著增加ATF6转录因子的转录活性（P<0.01）；诱导XBP-1基因mRNA的选择性剪切，暗示XBP-1蛋白转录活性提高；同时上调了多种内质网应激反应标记基因的表达，如BiP，ATF4，CHOP等，说明托芬那酸全面激活了内质网应激介导的未折叠蛋白反应（UPR）信号通路。添加托芬那酸导致HCT116细胞中eIF2α蛋白磷酸化增加，并且其磷酸化增加趋势与周期素D1蛋白下调速度相吻合，干扰介导该位点磷酸化的上游基因PERK表达显著影响周期素D1表达下调（P<0.01），说明PERK/eIF2α信号通路参与了托芬那酸抑制周期素D1蛋白翻译过程。5.研究托芬那酸介导的UPR信号与细胞凋亡发生之间的关联，结果显示：干扰PERK基因表达抑制了托芬那酸介导的eIF2α蛋白磷酸化水平升高，进而减弱了促凋亡蛋白ATF4和CHOP蛋白表达水平，说明托芬那酸激活了UPR信号通路的一个分支PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路。托芬那酸可以下调凋亡抑制蛋白Bcl-2表达，增加PARP蛋白裂解，从而诱导细胞凋亡，然而干扰ATF4基因表达会影响这些事件的发生。以上研究表明这些信号通路的激活对托芬那酸诱导细胞凋亡起一定作用。综上所述，托芬那酸处理诱导了大肠癌细胞的内质网应激反应介导的一系列信号通路激活，有差别地调控了抗凋亡蛋白如周期素D1，Bcl-2等和促凋亡蛋白如ATF4，CHOP等蛋白的表达水平，最终引起细胞增殖阻滞。本研究系统深入的阐明了托芬那酸调控大肠癌细胞中周期素D1表达的分子机理，并首次揭示了托芬那酸激活内质网应激反应信号通路，为更好地理解托芬那酸抑制癌症细胞生长的分子机理提供了新的理论依据。