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缺血再灌注肺损伤（ischemia-reperfusion lung injury）常见于肺移植、肺栓塞溶栓治疗、单肺通气术后、张力性气胸及各种体外循环等临床事件,是导致患者术后呼吸功能障碍的主要原因之一,目前对缺血再灌注肺损伤的具体机制仍不清楚。铁死亡是一种铁依赖的调节性细胞死亡形式,其特点是谷胱甘肽过氧化物酶4（Glutathione Peroxidase 4,GPX4）活性缺失或活性不足,多不饱和脂肪酸氢过氧化物清除降低诱发的一种特殊形式的细胞死亡。GPX4在铁死亡发生发展过程中发挥重要的调控作用。研究表明,缺血再灌注会加重活性氧蓄积和组织损伤,但肺缺血再灌注能否通过铁死亡加重急性肺损伤尚不明确。长链非编码RNAs（long non-coding RNAs,LncRNAs）是长度超过200个核苷酸,且一般不编码蛋白质的RNA,而在基因组中存在普遍转录现象,并对基因调控发挥重要作用。最近的研究发现LncRNAs通过与DNA、RNA和蛋白质的特异性相互作用,可以调节染色质功能、mRNA转录和翻译,并干扰信号通路。我们对缺血再灌注肺损伤模型进行高通量转录组测序,利用生物信息技术筛选差异表达的铁死亡相关分子,探索铁死亡在缺血再灌注肺损伤中的作用及相关调控机制。目的:观察肺缺血后再灌注时间与肺损伤的关系,探讨缺血再灌注肺损伤大鼠铁死亡相关指标的变化及抑制铁死亡对缺血再灌注肺损伤的影响。方法:1.构建大鼠肺缺血再灌注模型,在肺缺血1h再灌注0.5h、1h和2h等不同时间点观察大鼠肺氧合指数、肺湿干重比（W/D）、肺组织HE染色和肺组织损伤评分、肺泡灌洗液TNF-α和IL-6水平;2.将大鼠随机分为sham组、Fer-1组、IR组和IR+Fer-1组,检测各组大鼠肺组织GSH和MDA水平、肺组织铁沉积变化、肺组织GPX4和ACSL4蛋白表达,观察各组氧合指数、W/D、肺组织HE染色及肺组织损伤评分,ELISA检测各组大鼠肺泡灌洗液炎症因子TNF-α和IL-6水平。结果:1.与sham组相比,大鼠肺缺血再灌注后0.5h出现肺氧合指数下降,肺湿干重比和肺组织损伤评分增高,肺泡灌洗液炎症因子TNF-α和IL-6水平升高,且随着再灌注时间延长肺损伤指标呈加重趋势。2.与sham组相比,缺血再灌注大鼠肺组织GSH下降、MDA升高、肺组织铁含量增加,铁死亡相关蛋白GPX4表达下调、ACSL4表达上调,且使用铁死亡抑制剂Fer-1显著减轻上述铁死亡相关指标变化,说明缺血再灌注肺损伤存在铁死亡。3.与IR组大鼠比较,使用铁死亡抑制剂Fer-1改善缺血再灌注肺损伤大鼠肺氧合指数,降低肺W/D和肺组织损伤评分,下调肺泡灌洗液炎症因子TNF-α和IL-6水平,说明抑制铁死亡可以减轻缺血再灌注肺损伤。结论:肺缺血再灌注诱发急性肺损伤,且肺损伤程度与再灌注时间有关;铁死亡参与缺血再灌注肺损伤,抑制铁死亡可以减轻缺血再灌注肺损伤。目的:观察缺氧复氧对大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞LncRNA-6524和GPX4表达的影响,明确LncRNA-6524对GPX4的调控关系;探讨LncRNA-6524对大鼠缺氧复氧肺泡Ⅱ型上皮细胞铁死亡的调控作用及机制。方法:1.构建缺血再灌注大鼠肺损伤模型,对肺组织行高通量测序,筛选前20位差异表达基因,通过序列比对和靶点预测发现LncRNA NONNRATT026524.2（LncRNA-6524）和铁死亡相关基因GPX4存在调控关系,使用q RT-PCR验证大鼠缺血再灌注肺损伤模型LncRNA-6524和GPX4表达变化;2.检测大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞（RLE-6TN）在缺氧24h复氧不同时间点LncRNA-6524和GPX4表达及LncRNA-6524核定位;3.使用过表达LncRNA-6524慢病毒转染RLE-6TN细胞获得过表达LncRNA-6524稳转细胞株,然后构建细胞缺氧复氧模型,观察过表达LncRNA-6524对缺氧复氧RLE-6TN细胞铁死亡指标的影响;4.构建沉默LncRNA-6524稳转RLE-6TN细胞株,观察沉默LncRNA-6524对缺氧复氧RLE-6TN细胞铁死亡指标的影响;5.在过表达LncRNA-6524的RLE-6TN细胞转染sh-GPX4慢病毒沉默GPX4表达,构建缺氧复氧细胞模型,观察LncRNA-6524和GPX4对缺氧复氧RLE-6TN细胞铁死亡的调控作用。结果:1.对缺血再灌注肺组织行转录组高通量测序,筛选前20位差异表达的LncRNA和mRNA（|log2FC|＞2,P＜0.01）,并通过qRT-PCR验证显示铁死亡相关基因GPX4和LncRNA-6524在大鼠缺血再灌注肺损伤模型中表达下调,通过序列间比对、靶点预测等生物信息技术发现LncRNA-6524与GPX4存在靶向调控关系。2.RLE-6TN细胞缺氧24h后复氧1h、2h、4h等不同时间点LncRNA-6524和GPX4 mRNA表达明显下降,在复氧2h时间点LncRNA-6524和GPX4 mRNA下降最为明显,GPX4蛋白表达呈同步下降,在复氧2h时间点最为明显;核质分离后qRT-PCR检测发现LncRNA-6524主要定位在细胞核。3.缺氧复氧诱导RLE-6TN细胞活力下降,细胞GSH水平降低,MDA和Fe2+水平升高,细胞线粒体膜电位降低,铁死亡相关蛋白GPX4下调、ACSL4上调。4.过表达LncRNA-6524使缺氧复氧RLE-6TN细胞GPX4 mRNA表达上调,细胞活力增加,细胞GSH水平升高,细胞MDA和Fe2+水平降低,细胞线粒体膜电位升高,铁死亡相关蛋白GPX4上调、ACSL4下调。5.沉默LncRNA-6524表达使缺氧复氧RLE-6TN细胞活性下降,细胞GSH水平下调、MDA和LDH水平升高,细胞线粒体膜电位降低,铁死亡相关分子GPX4 mRNA下调、ACSL4mRNA和PTGS2 mRNA上调,GPX4蛋白下调、ACSL4蛋白上调。6.沉默GPX4表达阻断了过表达LncRNA-6524对缺氧复氧RLE-6TN细胞铁死亡抑制作用,表现为细胞活性下降,细胞GSH水平降低、MDA和LDH升高,细胞线粒体膜电位降低,铁死亡相关蛋白GPX4 mRNA和蛋白表达降低,ACSL4蛋白表达升高。结论:1.缺氧复氧诱导大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞发生铁死亡;2.缺氧复氧诱导大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞LncRNA-6524和GPX4表达下调,且LncRNA-6524与GPX4存在正向调控关系;3.LncRNA-6524通过靶向GPX4调控缺氧复氧大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞铁死亡。目的:明确缺血再灌注肺损伤LncRNA-6524表达下调的机制,阐明LncRNA-6524启动子去甲基化对缺血再灌注肺损伤的保护作用及机制。方法:1.CCK-8检测不同浓度DNA甲基化抑制剂5-Aza对RLE-6TN细胞活性影响及不同浓度5-Aza对缺氧复氧RLE-6TN细胞活性影响;2.使用生物信息学预测、MSP和CHIP方法检测缺血再灌注肺损伤模型LncRNA-6524启动子甲基化状态及5-Aza预处理对其甲基化状态的影响;3.使用DNA去甲基化、慢病毒转染基因沉默、缺血再灌注肺损伤体外模型构建等技术,明确LncRNA-6524启动子去甲基化对缺氧复氧RLE-6TN细胞铁死亡相关指标的影响;4.通过5-Aza诱导DNA去甲基化、气道滴入转染sh-LncRNA-6524慢病毒沉默大鼠LncRNA-6524表达、构建大鼠缺血再灌注肺损伤模型等方法,观察LncRNA-6524启动子去甲基化对缺血再灌注肺损伤大鼠肺组织铁死亡和肺损伤相关指标的影响。结果:1.对LncRNA-6524启动子序列进行生物信息学分析,结果发现LncRNA-6524启动子存在6个Cp G岛,MSP检测发现缺血再灌注肺组织存在LncRNA-6524启动子甲基化,而正常肺组织未发现LncRNA-6524启动子甲基化。2.与对照组相比,5-Aza（5μM）对RLE-6TN细胞活性无明显影响,且增加缺氧复氧RLE-6TN细胞活性;使用MSP检测发现5-Aza（5μM）预处理使缺氧复氧RLE-6TN细胞LncRNA-6524启动子去甲基化;ChIP检测发现缺氧复氧RLE-6TN细胞LncRNA-6524启动子区DNMT1和DNMT3a/b富集增加,而5-Aza预处理使缺氧复氧RLE-6TN细胞LncRNA-6524启动子区DNMT1和DNMT3a/b的富集降低。3.与对照组比较,缺氧复氧RLE-6TN细胞LncRNA-6524表达减少,5-Aza预处理缺氧复氧RLE-6TN细胞使LncRNA-6524表达明显上调、GPX4mRNA和蛋白表达上调,而沉默LncRNA-6524表达则阻断5-Aza预处理对LncRNA-6524、GPX4表达上调作用。4.5-Aza预处理可使缺氧复氧RLE-6TN细胞活性增加,细胞GSH水平升高,MDA水平下降,细胞脂质ROS降低,铁死亡相关分子GPX4表达上调、ACSL4表达下调,细胞线粒体形态正常化;而沉默LncRNA-6524表达阻断了5-Aza预处理对缺氧复氧RLE-6TN细胞铁死亡的抑制作用。5.与假手术组相比,缺血再灌注肺损伤大鼠LncRNA-6524表达减少,使用5-Aza预处理使缺血再灌注肺损伤大鼠肺组织LncRNA-6524表达明显上调,GPX4 mRNA表达上调,而沉默LncRNA-6524表达则阻断5-Aza预处理对LncRNA-6524、GPX4 mRNA的上调作用。6.5-Aza预处理使缺血再灌注肺损伤大鼠肺组织GSH水平升高,MDA水平下降,GPX4蛋白表达上调、ACSL4蛋白表达下调,肺组织损伤评分和肺组织W/D降低,肺氧合指数升高,肺泡灌洗液TNF-α和IL-6水平降低;免疫组化显示5-Aza预处理减轻IR大鼠肺损伤程度,同时肺组织GPX4蛋白表达增加,PTGS2表达减少;而沉默LncRNA-6524表达则阻断5-Aza预处理对大鼠缺血再灌注肺损伤的保护作用。结论:1.肺缺血再灌注诱导LncRNA-6524启动子甲基化;2.LncRNA-6524启动子去甲基化上调缺血再灌注肺损伤大鼠LncRNA-6524和GPX4表达。3.LncRNA-6524启动子去甲基化上调GPX4表达,抑制铁死亡减轻缺血再灌注肺损伤。