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多种肿瘤细胞包括肝癌细胞表现出“有氧糖酵解”特性,即在有氧的条件下也依赖糖酵解产生ATP,同时,线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)功能降低,肿瘤细胞的这种代谢重构现象称为“Warburg effect”。近来研究发现,肿瘤细胞的药物抵抗与糖代谢重构相关,由于不同肿瘤细胞代谢方式存在差异,有的研究推测肿瘤细胞的代谢改变可能与药物抵抗存在关系。丙酮酸脱氢酶激酶(PDK1)作为糖代谢的关键酶,在多数肿瘤细胞中高表达,且PDK1高表达的肿瘤预后较差。PDK1能够磷酸化丙酮酸脱氢酶(PDH)抑制其活性(因为PDH的抑制与“Warburg effect”相关),减少丙酮酸进入线粒体代谢,这被称为肿瘤细胞代谢重编程的重要部分。越来越多的研究证明PDK1在肿瘤细胞糖代谢中发挥了重要作用。DCA是PDK的小分子抑制剂,能够通过抑制PDK的活性进而活化PDH,使得代谢流由糖酵解转向线粒体有氧氧化,进而活化线粒体途径的凋亡。本研究组在对肝癌细胞进行实验研究时发现,PDK1在BEL-7402细胞中的表达明显高于HepG2细胞,且BEL-7402细胞对DCA敏感性较差,这提示肝癌细胞对PDK1的依赖程度与肿瘤药物抵抗间存在关系,但其具体机制尚不明确。本研究主要分析肝癌细胞HepG2和BEL-7402代谢方式差异,同时通过干扰肿瘤细胞糖代谢方式,诱导线粒体应激,增加细胞药物敏感性,为临床个体化治疗提供思路。实验方法:(1)MTT法检测DCA对HepG2和BEL-7402细胞活力的影响;流式细胞术检测细胞凋亡;Western Blot检测凋亡相关蛋白变化。(2)葡萄糖氧化法和比色法分别检测两株肝癌细胞外液中的葡萄糖和乳酸水平;q PCR检测糖酵解相关酶基因表达;比色法检测LDH酶活性;流式细胞术检测mROS及比色法检测柠檬酸的含量;Western Blot检测糖酵解蛋白的表达。(3)葡萄糖、乳酸试剂盒检测细胞葡萄糖摄取和乳酸生成的变化;实时定量PCR及Western Blot检测DCA对糖酵解相关酶基因及蛋白的影响;试剂盒检测LDH酶活性的变化;PCR及Western Blot检测缺氧诱导因子HIF-1α表达的变化。(4)流式细胞术检测m ROS及膜电势的变化;柠檬酸试剂盒检测线粒体内柠檬酸的产量变化;Mito Tracker染色后激光共聚焦观察线粒体形态的变化。(5)根据RNAi原理,构建sh-PDK1质粒并转染细胞,倒置荧光显微镜观察mROS的生成改变;分光光度法检测葡萄糖消耗和乳酸生成;流式细胞术检测细胞凋亡;PCR和Western Blot检测糖酵解相关基因和蛋白的表达。结果:(1)DCA以剂量依赖方式抑制HepG2细胞的活力并促进其凋亡;DCA 80m M时能够明显抑制BEL-7402细胞活力,但无明显促凋亡作用。(2)通过检测HepG2和BEL-7402细胞基础水平的糖代谢相关指标,发现BEL-7402细胞糖酵解相关基因及蛋白表达较高,细胞外液中乳酸水平及LDH活性也高于HepG2细胞,同时,线粒体ROS及柠檬酸盐含量低于HepG2细胞。(3)DCA能够抑制HepG2和BEL-7402细胞的葡萄糖摄取及乳酸生产,LDH活性及糖酵解相关因子HK2、LDHA、HIF-1α、GLUT1、GLUT4等蛋白和基因的表达,且对HepG2的抑制效果更为明显。(4)DCA能够明显诱导HepG2细胞线粒体内ROS和柠檬酸盐的生成,导致膜电势下降,BEL-7402细胞的变化则不明显。同时,DCA能够影响HepG2细胞线粒体的动力学,使其融合分裂平衡打破,但对BEL-7402细胞的作用并不明显。(5)敲除PDK1,能够明显降低HepG2细胞的细胞活力并促进其凋亡,并且能够抑制HepG2糖酵解相关基因及蛋白的表达,降低细胞外液葡萄糖及乳酸的生成,增加线粒体内ROS的生成;对于BEL-7402细胞,敲除PDK1不能导致细胞凋亡,并且没有明显改变Bel-7402细胞的糖代谢。实验结论:1.DCA能够抑制HepG2细胞糖酵解,恢复其线粒体氧化磷酸化功能,并增加线粒体途径的凋亡敏感性。2.BEL-7402细胞的糖代谢模式受DCA影响不显著,且其对DCA敏感性较低。3.BEL-7402细胞对DCA不敏感可能与其对PDK1途径依赖程度较低有关。