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睾丸支持细胞(Sertoli cells,SCs)是生精上皮中唯一的体细胞,主要为生精细胞提供支持和营养,同时还具有调控精子发生的功能。SCs的分离培养对体外探讨精子发生机理至关重要。目前,人和小鼠SCs的相关研究已取得显著进展,有关猪、牛SCs的分离培养、紧密连接形成及发育、分化相关功能基因克隆及分析等研究已有报道。但因牛新鲜睾丸取材不便、价格昂贵及取材时间不确定等因素,使牛SCs相关研究进展缓慢。为解决以上问题,本研究在前期基础上进一步探讨了从冷冻保存的新生牛睾丸组织中分离纯化SCs的可行性。将冻存的1日龄牛睾丸组织复苏,进行形态学检查和SCs的分离培养。石蜡切片苏木精-伊红(HE)染色显示,曲细精索及睾丸间质保存完好。二步酶消化结果显示,生精上皮解离良好。利用差异贴壁法将原代细胞纯化后扩大培养,绝大多数细胞呈不规则多边形,3 d即可生长至汇合。RT-PCR分析显示,贴壁细胞表达SCs阳性分子标记(Gdnf、Abp)而不表达精原细胞分子标记PLZF。免疫荧光染色显示,贴壁细胞表达SCs的蛋白标记GDNF和ABP。流式细胞术检测显示,所获细胞纯度可达90%以上。上述结果表明,从冻存的新生牛睾丸组织中可获高纯度的SCs。诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)是一类与ESCs(embryonic stem cells,ESCs)的形态、生长方式以及生物学特性极其相似的多能性细胞。目前,小鼠、大鼠和人iPSCs诱导、培养体系的建立、鉴定及重编程机制的相关研究已有报道。但在大家畜牛中,iPSCs的建立仍存在诸多问题,如供体细胞获取不便、诱导效率低、体外培养过程中易分化、干细胞特性难以维持、特异性标记存在争论等。这些问题说明牛iPSCs的生物学特性及体外培养条件与啮齿类和人iPSCs的差异较大。有研究表明,利用经典四因子法(Oct4、Sox2、Klf4、C-myc,OSKM),可将小鼠的SCs重编程为iPSCs。根据SCs增殖迅速、形态均一、免疫原性低而且幼稚SCs表现出一定干细胞特征等生物学特性,本研究摸索了新生牛SCs重编程为iPSCs的诱导体系及其冻存条件。碱性磷酸酶(AP)染色显示,所获牛iPSCs表达高水平的AP活性;免疫荧光染色显示,牛iPSCs表达多种多能性标记;畸胎瘤及拟胚体形成结果表明,所获牛iPSCs在体内外均可分化为三胚层来源的组织;RNA-seq分析表明,牛iPSCs的多能性(Oct4、Sox2、Nanog、Tet1/3、Klf4)和抗凋亡相关基因(Bcl2)上调而周期相关基因(P21、Casp3)下调,同时涉及有干细胞干性维持、细胞代谢、蛋白结合以及细胞膜和细胞核等相关通路共同调控牛iPSCs的生长发育及凋亡过程。荧光定量PCR结果显示,血清替代物(knockout serum replacer,KSR)冻存组iPSCs的多能性(Oct4、Sox2)和促凋亡相关(Bax)基因显著上调而抗凋亡基因(Bcl2)下调;AP染色显示,胚胎干细胞-胎牛血清(embryonic stem cells-fetal bovine serum,ES-FBS)冻存组的AP的表达较强;体内畸胎瘤形成实验进一步表明,复苏冷冻保存的iPSCs,在体内仍可发育形成畸胎瘤并具有三胚层的结构。综上所述,本研究获得了纯度较高的新生牛睾丸SCs,利用经典四因子法将其诱导为iPSCs,进而通过转录组分析在SCs向iPSCs重编程过程中所涉及到的相关通路,最后研究了牛iPSCs的冷冻保存条件及其复苏后的干细胞潜能。本研究建立了SCs来源的牛iPSCs,探讨了其重编程机制,为其应用奠定了基础。