生物膜是一种附着于人体组织或生物医疗器材表面,由胞外基质包裹细胞而产生的一种或多种生物群体。近年来,随着恶性肿瘤、自身免疫病、艾滋病等发病率的升高,广谱抗生素、皮质激素和免疫抑制剂的广泛使用,使得真菌感染的发病率不断上升,特别由于呼吸机等医疗生物材料的大量应用,生物膜相关性真菌的感染发生率不断增加。临床上生物膜感染常常涉及混合感染,白色念珠菌是第四位引起医院血流感染和第三位引起导管插管感染的分离真菌,它的致死率高达62%。表皮葡萄球菌是滋生于人体表皮的正常菌群类型,也是医院交叉感染的重要来源,它易于在生物材料上形成生物膜而成为医用生物材相关感染的主要致病菌。研究发现,当白色念珠菌和表皮葡萄球菌的感染同时存在时,常常涉及混合生物膜的形成,从而导致感染反复发作而难以治愈,因此寻找治疗白色念珠菌和表皮葡萄球菌混合生物膜感染的途径倍受关注。近来氟康唑在临床上广泛应用于白色念珠菌感染的治疗,但随着氟康唑应用的增多,白色念珠菌的耐药性不断出现。现有临床可用的抗真菌药物不仅品种有限,且价格昂贵,毒副作用大,于是通过采用非抗真菌药物与氟康唑联合的方法来增加氟康唑对白色念珠菌的敏感性。在本课题预实验的过程中,初步发现多西环素与氟康唑联用对白色念珠菌有一定的协同抗真菌作用。多西环素和氟康唑联用对生物膜,特别是白色念珠菌和表皮葡萄球菌形成的混合生物膜是否同样具有协同作用,作用强度、特征及机制等都有待于进一步研究。本实验研究多西环素和氟康唑联合对白色念珠菌和表皮葡萄球菌混合生物膜的体外作用,并从耐药基因表达、胞内钙水平变化和细胞周期改变三个方面探讨机制。希望通过作用研究为临床治疗混合生物膜的感染提供思路,通过机制研究为抗感染药物开发新靶点提供线索。1.适合白色念珠菌和表皮葡萄球菌生长的培养基筛选在固体培养基的筛选上,以平板划线法,观察加入不同的营养成分配比后白色念珠菌和表皮葡萄球菌的菌落24h和48h生长状态。同时观察加入羊血和钙离子对生长的影响,发现两者不能同时促进真菌和细菌的生长。最终确定以下配比为最佳：酵母膏0.25%,牛肉粉0.25%,蛋白胨1.25%,琼脂粉1.625%,葡萄糖0.5%和氯化钠0.375%。在液体培养基的筛选上,将菌液和不同配比的培养基成分加入96孔板中,观察24h和48h生长结果,最终确定以下配比为最适合真菌和细菌生长的液体培养基：RPMI16400.52%,MOPS1.7265%,碳酸氢钠0.1%,葡萄糖0.225%,胰蛋白胨0.85%,植物蛋白胨0.15%,氯化钠0.25%,磷酸氢二钾0.125%。通过以上适合真菌和细菌共同生长固体和液体培养基成分的筛选,为接下来药物联用对混合生物膜作用和机制的研究作准备。2.氟康唑和多西环素联合抗白色念珠菌生物膜的作用本实验按照CLSI M27-A3方案,通过微量稀释法测定了一定浓度多西环素(0.5-64μg/mL)和氟康唑联用对十株不同敏感性的白色念珠菌浮游及生物膜状态的作用,并比较了联合药物对经过三个成膜时间(4,8和12h)形成的生物膜的影响。通过XTT法测定药物作用后混合生物膜的活性,FICI和ΔE两种模型用于评价药物的相互作用。结果表明,对于浮游菌来说,协同作用随着菌株的耐药程度不同而不同：对耐药和剂量依耐性敏感菌株表现出强协同作用,而对敏感菌株表现出无关作用；对于生物膜来说,药物联用对所有菌株的各个成膜时间形成的生物膜均表现出协同作用,作用随着成膜时间的增长而减弱,本实验还发现药物对生物膜的作用弱于浮游菌。本实验结果对于寻找新的抗真菌制剂和临床上克服白色念珠菌生物膜感染具有一定的意义。3.氟康唑和多西环素联合抗白色念珠菌和表皮葡萄球菌混合生物膜的作用本实验以不同敏感程度的白色念珠菌和表皮葡萄球菌形成生物膜,以微量稀释法测定氟康唑和多西环素联用对混合生物膜的作用,以浮游菌的作用结果做对照。通过XTT法测定药物作用后混合生物膜的活性,以FICI法和ΔE法分析药物联合作用的结果,并讨论结果的一致性。结果表明,氟康唑和多西环素联用对各种耐药程度组合的浮游菌和生物膜都表现出协同作用,作用程度的强弱主要和白色念珠菌的耐药性有关,药物对于耐药白色念珠菌组成的混合生物膜作用弱于敏感菌,由此可以推测联合药物对混合生物膜的协同作用主要针对白色念珠菌。4.药物联用对混合生物膜内白色念珠菌和表皮葡萄球菌各自作用的评价为了进一步证明联合药物对混合生物膜内白色念珠菌和表皮葡萄球菌各自生长的影响,本实验利用选择性适合白色念珠菌和表皮葡萄球菌生长的TTC-沙保罗培养基和甘露醇高盐琼脂培养基,将药物作用前后的混合浮游和生物膜内的真菌和细菌分离,用菌落计数法测定各菌株的量变,以此评价药物对各菌株生长的作用。结果表明,影响白色念珠菌数量的主要原因是药物联用的协同作用和营养限制,而影响表皮葡萄球菌数量的主要原因是营养限制和多西环素的作用,由此推测药物的协同作用主要是针对白色念珠菌,进一步验证了上一章的结果。5.药物联用对混和生物膜内白色念珠菌耐药基因表达的影响本实验以普通逆转录PCR (reverse transcription PCR)和实时荧光定量PCR(realtime PCR)分别测定单独生物膜(单膜)和混合生物膜(混膜)内白色念珠菌耐药基因CDR1、CDR2和MDR1的表达,其中实时荧光定量PCR的结果用2-ΔΔct法分析。结果表明,单膜和混膜内白色念珠菌耐药基因的表达情况相似,对于CDR1和MDR1基因,多西环素单用和生长对照的表达无显著差异,氟康唑单用可引起基因过度表达,当多西环素和氟康唑联用后表达显著降低；对于CDR2基因,相较于生长对照组,多西环素单用引起基因表达显著降低,单膜和混膜的氟康唑单用结果不一致(单膜内引起基因过度表达,混膜则无显著改变),但是药物联用较氟康唑单用的表达水平均显著降低。由此可以推测,药物联用的协同作用和阻滞了白色念珠菌外排泵编码基因CDR1、CDR2和MDR1的过度表达有关。6.药物联用对混和生物膜内白色念珠菌内钙水平的影响本实验首先以平板划线法评价钙通道阻滞剂(贝尼地平和硝苯地平)对氟康唑和多西环素的协同作用的影响,结果发现钙通道被阻滞后,联合药物的协同作用增强,于是推测协同作用的发生机制和钙相关,为了进一步验证推测,我们选择新一代钙离子敏感的荧光探针Fluo-3AM,以荧光显微镜初步观察药物作用对胞内钙离子浓度的影响,以流式细胞术进一步定量评价联合药物作用后胞内钙离子浓度的改变,结果表明,生长对照和多西环素单用均对白色念珠菌的胞内钙离子浓度不产生影响；氟康唑单用4h后胞内钙离子急剧升高,且在8h时达到最高值；药物联用组同样在作用4h后引起钙离子快速升高,但在8h后开始缓慢上升,并高于氟康唑单用组。对照白色念珠菌单膜和混膜的结果发现,药物引起的钙离子变化没有明显差异。由此推测,氟康唑和多西环素联用的机制和加速了白色念珠菌胞内钙离子紊乱有关。7.药物联用对混合生物膜内白色念珠菌细胞周期的影响本实验以流式细胞术测定药物联用对单膜和混膜内白色念珠菌细胞周期的影响。结果发现对于单膜,氟康唑单用和药物联用组均导致细胞阻滞在G2/M期,氟康唑单用的作用强于药物联用；对于混合生物膜,生长对照,多西环素、氟康唑单用,两药联用组的细胞周期差异不显著,由此看来,氟康唑本身可以阻滞白色念珠菌的细胞周期,而药物联合并不是通过影响细胞周期发挥协同作用的。同时我们对照单膜和混膜内白色念珠菌细胞周期的结果发现,和表皮葡萄球菌混合生长的白色念珠菌表现出显著的G2/M期阻滞,也就是说混合生物膜内的白色念珠菌的活力和生长状态受到抑制。综上所述,我们发现氟康唑和多西环素联用对白色念珠菌和表皮葡萄球菌混合生物膜具有协同作用,作用机制主要与阻滞了白色念珠菌药物外排泵基因CDR1, CDR1及MDR1(?)勺表达和导致白色念珠菌胞内钙紊乱有关。