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白细胞介素-7是机体重要的免疫调节因子，主要功能是促进B细胞和T细胞生长及抗凋亡作用，目前正在探讨利用IL-7对相关疾病进行治疗；白细胞介素-7剪接变异体来源于IL-7基因，但其蛋白质一级结构与IL-7有差异，其功能可能参与IL-7功能调节；目前对其功能的研究才刚刚起步。本文将从肝癌细胞株HepG2、结肠癌细胞株 HT29中克隆得到 IL-7及其剪接变异体cDNA，利用原核表达载体pET-21b表达IL-7及其在开放阅读框架内的剪接变异体，并鉴定这些剪接变异体蛋白质，为进一步研究IL-7剪接变异体的生物活性奠定物质基础。 实验方法： 1.白细胞介素-7(IL-7)及其剪接变异体cDNA的获取和克隆：用Trizol试剂分别从肝癌细胞株HepG2、结肠癌细胞株HT29中提取总RNA,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增出白细胞介素-7(IL-7)及其剪接变异体的cDNA，将目的片段分别克隆进TA载体中，进行PCR和测序鉴定。 2.构建重组IL-7与在其开放阅读框架内剪接变异体的表达载体：将IL-7及其开放阅读框架内的剪接变异体如缺乏第4外显子(IL-7delta4)、缺乏第3、4外显子(IL-7delta3/4)、缺乏第4和5外显子(IL-7delta4/5)、缺乏第3、4和第5外显子(IL-7delta3/4/5)克隆进表达载体中，进行PCR、测序鉴定。 3. IL-7及其剪接变异体的原核表达与鉴定：将上一步所得的重组表达质粒转化入BL21(DE3)中，PCR鉴定后，进行诱导表达。采用SDS-PAGE、Western Blot方法对表达产物进行分析。 4. IL-7及其剪接变异体蛋白质的生物信息学分析：运用网上的分析软件对IL-7与在其开放阅读框架内剪接变异体的蛋白质的生物信息学进行分析。 实验结果： 1.白细胞介素-7(IL-7)及其剪接变异体基因的克隆：以肝癌细胞株 HepG2、结肠癌细胞株 HT29中提取的总RNA为模板，经RT-PCR扩增所得片段全部克隆进入TA载体中，经PCR和测序鉴定，结果表明：所获得的IL-7的基因序列与 GenBank公布的序列完全一致；得到在 IL-7开放阅读框架内的基因有399 bp的缺乏第4外显子(IL-7delta4)、318 bp的缺乏第3、4外显子(IL-7delta3/4)、345 bp的缺乏第4和5外显子(IL-7delta4/5)、264 bp的缺乏第3、4和第5外显子(IL-7delta3/4/5)；不在IL-7开放阅读框架内剪接变异体有343bp的缺乏第2、4外显子(IL-7delta2/4)、268 bp的缺乏第2、3、4外显子(IL-7delta2/3/4)、181 bp的缺乏第2、3、5外显子(IL-7delta2/3/5)、289 bp的缺乏第2、4、5外显子(IL-7delta2/4/5)、208 bp的缺乏第2、3、4、5外显子(IL-7delta2/3/4/5)。 2.构建重组IL-7及其剪接变异体的原核表达载体：将IL-7及其剪接变异体亚克隆入原核表达载体 pET21b中，经 PCR、测序鉴定后，成功构建 pET21b-IL-7、pET21b-IL-7delta4、pET21b-IL-7delta3/4、pET21b-delta4/5、pET21b-IL-7delta3/4/5表达质粒。 3. IL-7及其剪接变异体的原核表达与鉴定：将pET21b-IL-7、pET21b-IL-7delta4、pET21b-IL-7delta3/4、pET21b-delta4/5、pET21b-IL-7delta3/4/5表达质粒转化进表达蛋白的大肠杆菌BL21后，用IPTG来诱导表达，表达产物用SDS-PAGE、Western Blot分析为目的蛋白。 4. IL-7及其剪接变异体蛋白质的生物信息学分析：预测得到IL-7及其剪接变异体蛋白质的理化性质和二级、三级结构数据。 结论： 本研究分别从肝癌细胞株HepG2、结肠癌细胞株 HT29中提取总 RNA，进行RT-PCR,获得与GenBank公布序列完全一致的IL-7序列和一系列IL-7剪接变异体。经测序鉴定得到IL-7及4个在IL-7开放阅读框架内的剪接变异体。将其亚克隆入原核表达质粒pET21b，成功构建了重组原核表达质粒pET21b-IL-7、pET21b-IL-7delta4、pET21b-IL-7delta3/4、pET21b-IL-7delta4/5、pET21b-IL-7delta3/4/5，转化进入大肠杆菌BL21后，用IPTG作为诱导剂诱导表达，表达产物用SDS-PAGE、Western Blot分析为目的蛋白。并在网上用分析软件分析IL-7及其剪接变异体蛋白质的理化性质和二级、三级结构。