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蚕是重要的经济昆虫,同时也是鳞翅目的模式昆虫,蚕丝产业在我国拥有5000多年的悠久历史,在社会经济文化生活中占有重要地位。同时,家蚕功能基因组学的研究将为全面、准确地了解家蚕生物性状的遗传基础和分子调控机制,为改善蚕丝产业提供理论基础和技术支持,也为解明基础生物学现象提供依据。
因此,本论文课题通过实验和生物信息学相结合的方法克隆得到了两个家蚕基因,并对这些基因做了初步的结构和功能分析。主要研究结论如下:
1.利用电子克隆方法得到了家蚕死亡相关蛋白基因(death-relatedprotein,DRP)的全长cDNA序列,并运用相关的生物信息学软件对其进行了分析。结果表明:该基因基因全长为761bp,开放阅读框(ORF)长为306bp,含有2个外显子和3个内含子,编码102个氨基酸,相对分子质量约为21 kD,位于家蚕的20号染色体上,编码的蛋白与其他物种的相应蛋白具有较高的同源性。设计引物扩增该基因,克隆测序结果与预期一致,序列提交NCBI库(GenBank no:FJ447481)。通过RT-PCR发现该基因在各组织和各发育阶段中均有表达。将DRP基因克隆到大肠杆菌表达载体pET30a的EcoR I和Xhol I位点中,构建了pET30a/DRP重组载体,阳性质粒转化E.coli BL21,使用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导DRP基因的表达,SDS-PAGE显示,在约21kDa处出现一条特异的蛋白条带。
2.用生物信息学方法得到家蚕唾液蛋白(salivary secreted protein,SSP)基因的序列,并且找到了该基因的全长cDNA序列。计引物扩增该基因,克隆测序结果与预期一致,序列提交NCBI库(GenBank no:FJ79024)。利用pET-30a表达系统,在大肠杆菌中表达了该基因,并利用Westrn证明了表达的正确性。RT-PCR结果显示该基因在各组织和各发育阶段中都有表达。利用抗核型多角体病毒家蚕近等基因系BC8、敏感性品系306研究了SSP在家蚕抗核型多角体病毒病中所起的作用。我们对这些家蚕品系添食病毒后各时间段的中肠进行了荧光定量PCR检测,发现抗性品系BC8中,SSP基因相对表达量随着时间的推移表达量呈现逐渐上调趋势,有趣的是,到24h以后又急速上升,维持在一个相对较高的水平。而在感性品种中,添加BmNPV病毒后没有多大变化。这可能说明SSP参与到了家蚕抗核型多角体病毒的免疫反应过程中。