丙酸是一种被广泛应用于食品、医药、农药、塑料等领域的典型大宗化学品。其制备方法主要包括化学合成法与生物发酵法，当前丙酸的产业化生产方法是化学合成法。随着社会低碳制造的需求及人们对天然绿色产物的需求，利用可再生资源发酵制备丙酸的呼声越来越高。目前发酵法生产丙酸工艺尚未成熟，生产成本居高不下，难以与化学合成法相抗衡，严重阻碍了其发展。关键问题主要集中在两个方面:一方面，丙酸发酵属于多产物共生体系，副产物多，丙酸纯度低;另一方面，由于产物抑制而导致了丙酸浓度低、发酵时间长、生产效率偏低的问题，现有工艺条件下难以实现高浓度与高纯度相统一，且相关碳源利用机制不明确。开展生物法制备丙酸及碳源利用机制的研究，开发高纯度、高产物浓度与高生产效率“三高”并存的新一代丙酸生产技术，对于实现生物法丙酸规模化生产具有重要的科学和现实意义。　　本课题以实验室筛选的费氏丙酸杆菌CCTCC M207015为研究对象，构建了不同碳源的丙酸代谢网络及其通量分析模型，分别通过生化调控和基因敲除策略减弱了丙酸合成副产物代谢途径并且改善了细胞的能量环境，实现了丙酸的高纯度生产。在此基础上利用实验室自主开发的高效植物纤维床反应器平台研究了丙酸的高浓度生产，最终实现了费氏丙酸杆菌的高纯度、高浓度、高产率丙酸生产。最后，通过蛋白质组学技术分析了不同碳源和调控策略下的细胞可溶性蛋白表达差异，对以上各种策略下的丙酸优化生产进行了一定的机理阐释。本论文主要研究工作分述如下:　　(1)分别构建了以葡萄糖和甘油为碳源的丙酸合成代谢网络，并建立了代谢通量模型。通过两种碳源的丙酸发酵不同阶段的代谢通量分布验证了模型的可靠性，并确定了网络的关键节点，分别是:葡萄糖-6-磷酸（甘油代谢为甘油醛-3-磷酸）、磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸。与葡萄糖代谢相比，虽然甘油代谢产生了1，3-丙二醇(PDO)途径，但是其丙酸途径得到了很大程度的增强，尤其是乙酸途径得到了显著的抑制。这为后续的高纯度丙酸研究提供了一定的理论依据。　　(2)首次在丙酸发酵中引入了氧化还原电位(ORP)的参数。通过自主筛选的两种ORP调节剂-铁氰化钾和硼氢化钠调控出了不同的ORP水平，基于各种ORP水平发酵参数的比较与其对菌体比生长速率和产物比合成速率的影响分析，提出了一种更有利于丙酸合成与纯度提升的ORP两步调控策略，即在发酵前156 h控制ORP为120 mV以有利于菌体合成和丙酸生成，156 h后控制ORP为80 mV更利于丙酸的高效生产，采用该策略丙酸发酵最终浓度达45.99 g/L，生产效率为0.192 g/L/h，副产物均有降低，丙酸占总有机酸比例高达92.26％。还从能量相关物质NADH/NAD+、ATP和代谢通量分布的角度对两步ORP调控策略增强丙酸生产与纯度提升进行了一定的机理阐释。　　(3)针对丙酸生物合成过程存在副产物PDO，以及消耗NADH，造成的产物抑制问题，利用重叠PCR策略构建了PDO合成途径关键酶甘油脱水酶基因敲除缺失的突变体，通过电转化将该质粒转化至出发菌株中形成重组菌GY-CF-4。重组菌与出发菌株相比，丙酸产量提高至36.97 g/L，甘油转化率由56.53％提高至61.62％，重要的是甘油脱水酶基因的敲除不仅使副产物PDO的产量降至微乎其微的程度，还使另一重要副产物乙酸的产量降到了原始菌的54.7％，重组菌的丙酸生产纯度得以进一步提升。　　(4)研究了植物纤维床反应器(Plant Fibrous-bed Bioreactor, PFB)对丙酸发酵的影响。发现PFB发酵在丙酸浓度和底物转化率的提升上优于游离细胞发酵，为进一步提高丙酸浓度，比较了不同补料策略对PFB发酵的影响，结果证明恒流补料策略为最优补料策略:丙酸浓度与生产效率分别为80.26 g/L和0.32g/L/h，丙酸纯度达93.03％。经10批次发酵，生产效率未有明显下降。代谢通量分析PFB批次发酵可以明显提升甘油醛-3-磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸三个节点的通量流向丙酸合成相关方向，恒流补料策略作为一种温和的补料策略能够维持以上优势。酶活变化与代谢通量分布变化基本一致。从膜结合H+-ATP酶、细胞膜磷脂脂肪酸变化以及胞内部分氨基酸水平变化的角度对PFB反应器驯化菌株对丙酸耐受机理进行了初步探讨。　　(5)为了更全面理解丙酸的高纯度、高浓度、高效率生产机制，建立了一套费氏丙酸杆菌胞内可溶性蛋白质组双向电泳技术平台。通过该技术平台分别对以甘油和葡萄糖为碳源时、以PFB固定化和游离细胞发酵时的菌体表达蛋白进行了比较研究。发现与葡萄糖为碳源时相比，甘油为碳源时细胞通过EMP途径蛋白表达上调、HMP途径和部分氨基酸代谢途径蛋白表达下调来调节底物利用、菌体合成和丙酸耐受性，能量代谢相关蛋白表达的上调则使还原性丙酸合成增强、氧化性的乙酸合成和菌体合成被抑制，所以甘油做碳源时细胞虽然长势不好、丙酸浓度也不高却可获得较高纯度;PFB发酵时细胞的甘油进入途径、HMP途径和丙酸合成途径相关蛋白表达上调说明PFB反应器在提高底物转化效率、促进菌体增殖形成细胞高密度发酵和提高丙酸的生产效率方面卓有成效，部分与氨基酸代谢相关蛋白的表达变化改变了胞内氨基酸水平则从理论上说明了PFB在调控丙酸杆菌进行高浓度丙酸生产上具有优势。