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背景和目的糖尿病（Diabetes mellitus,DM）是一种慢性代谢性疾病,其主要表现为高血糖,以及高血糖引起的代谢紊乱。糖尿病心肌病（Diabetic cardiomyopathy,DCM）是糖尿病常见的心血管并发病之一,会导致患者心力衰竭,严重威胁患者生命安全。褪黑素（Melatonin,MLT）是一种主要在人类和哺乳动物松果体产生的神经激素,并通过血液循环分泌到各种细胞中发挥调控作用。褪黑素可以通过诱导细胞产生抗氧化防御以及缓解细胞炎症和细胞凋亡,在缓解许多慢性疾病方面发挥着关键作用。非编码RNA（Non-codingRNA,ncRNA）由基因组转录而来,不翻译成蛋白质,在RNA水平上发挥调控作用。长链非编码RNA（long non-codingRNA,lncRNA）和微小RNA（microRNA,miRNA）是两种常见的非编码RNA。LncRNA可以充当竞争性内源RNA或海绵,降低靶向miRNA的功能可用性,参与基因表达的调控,其长度一般超过200个核苷酸。MiRNA通常与mRNA结合在转录后水平调控基因表达,其长度一般约为18-25个核苷酸。近年来的研究表明,非编码RNA在导致糖尿病心肌病的病理生理过程中发挥着至关重要的作用。本研究旨在进一步探究褪黑素对糖尿病患者心肌细胞的抗凋亡作用,并阐明与非编码RNA相关的潜在机制。方法体内实验:将Sprague Dawley（SD）大鼠随机分为正常组（N）,糖尿病组（DM）,胰岛素治疗组（DM+insulin）,褪黑素治疗组（DM+MLT）,每组12只,适应性饲养一周,然后腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）构建Ⅰ型糖尿病大鼠模型。一周后测血糖,血糖值≥11.1 mmol/L即认为模型构建成功,然后分别给予胰岛素（insulin,1 u/kg/d,前10周每天1次,后6周每天2次）和褪黑素（10mg/kg/d）进行治疗,治疗过程中给予SD大鼠普通食物和水喂养,并且每周测一次体重和血糖,16周后,通过麻醉进行安乐死,并快速分离心脏,采用Langendorff灌流实验进行心脏灌流。收集血清和心脏组织并保存,用于后续实验。通过ELISA实验检测SD大鼠血清中褪黑素浓度。通过H＆E染色和Masson染色观察糖尿病大鼠心脏形态学的改变;通过Langendorff灌流实验观察褪黑素处理对糖尿病大鼠的心脏功能的影响。通过Western blot实验观察褪黑素受体相关蛋白Mel-1A/B-R,NQO2蛋白,凋亡相关蛋白Bax,Bcl-2,caspase-3,caspase-9蛋白,MAPK通路相关蛋白p-JNK/JNK,p-ERK/ERK,p-p38/p38蛋白,内质网应激相关蛋白GRP-78,PERK,IRE1α,ATF-6α,ATF4,CHOP蛋白的表达情况。通过RT-qPCR观察lncRNA H19和miRNA-29c的表达情况。体外实验:采用含有高浓度葡萄糖（33m M）的培养基刺激大鼠心肌细胞H9c2细胞株来模拟糖尿病状态。将细胞分为正常糖浓度组（NG）,高糖浓度组（HG）,溶剂组（HG+DMSO）,胰岛素组（HG+insulin,1μM）,褪黑素组（HG+MLT,10μM）。通过Western blot实验观察褪黑素受体相关蛋白Mel-1A/B-R,NQO2蛋白,凋亡相关蛋白Bax,Bcl-2,caspase-3,caspase-9蛋白,MAPK通路相关蛋白p-JNK/JNK,p-ERK/ERK,p-p38/p38蛋白,内质网应激相关蛋白GRP-78,PERK,IRE1α,ATF-6α,ATF4,CHOP蛋白的表达情况。通过Hoechst染色实验观察在高糖刺激下,H9c2心肌细胞的凋亡情况。此外,还转染lncRNA H19 shRNA,miRNA-29c inhibitor,miRNA-29c mimic等,通过RTqPCR观察转染后lncRNA H19,miRNA-29c,MAPK13的表达变化,通过Western blot实验检测MAPK13蛋白的表达水平。根据生物信息学分析预测lncRNA H19和miR-29c可能的靶基因,然后通过双荧光素酶报告实验检测lncRNA H19和miRNA-29c,miRNA-29c和MAPK13的靶向情况,并通过RNA免疫沉淀（RNA immunoprecipitation,RIP）实验进一步确定lncRNA H19和miRNA-29c的靶向关系。通过caspase-3活性试剂盒和DNA fragment试剂盒检测转染后心肌细胞凋亡情况。结果体内实验:在实验过程中,我们发现糖尿病大鼠体重增长速度远慢于正常组,而且血糖一直处于高水平。给予胰岛素治疗可以促进糖尿病大鼠的体重增加和血糖降低。然而,给予褪黑素治疗的处理组没有这些影响。褪黑素浓度检测结果表明,糖尿病会抑制大鼠体内褪黑素的表达,褪黑素治疗组的褪黑素浓度明显高于糖尿病组。组织学染色显示,长期糖尿病会明显损伤心肌纤维并加剧胶原蛋白积聚。褪黑素的治疗缓解了糖尿病引起的这种病理损伤。与正常组相比,糖尿病组大鼠的心率、左心室发展压（left ventricular developmental pressure,LVDP）、冠状动脉流量、+dp/dt max和-dp/dt max明显降低,表明长期的高血糖导致严重的心肌功能障碍,而褪黑素治疗明显改善了糖尿病大鼠的心脏功能。我们发现,在糖尿病大鼠心肌组织内,褪黑素受体MT1和MT2（Mel-1A/B-R）以及NQO2蛋白的表达明显减少,褪黑素治疗后有明显改善。与正常组大鼠相比,糖尿病组大鼠的心肌组织中Bax/Bcl-2、cleaved-caspase9和cleaved-caspase3蛋白的表达明显上调,在褪黑素处理下趋于正常化。褪黑素还可以明显降低糖尿病大鼠心肌组织中JNK/ERK/p38蛋白磷酸化水平的升高。同时,褪黑素可以明显下调糖尿病大鼠心肌组织中GRP-78,PERK,IRE1α,ATF-6α,ATF4,CHOP蛋白表达的升高。在糖尿病病理状态下,lncRNA H19的表达增多而miRNA-29c的表达降低,同时褪黑素明显下调lncRNA H19并上调miR-29c水平。体外实验:在细胞实验中,褪黑素处理可以显著改善高浓度葡萄糖引起的MT1和MT2（Mel-1A/B-R）表达降低,但是高糖和褪黑素等处理对NQO2无明显影响。与正常组相比,高浓度葡萄糖处理会引起心肌细胞中Bax/Bcl-2、cleaved-caspase9和cleaved-caspase3蛋白的表达显著增多,褪黑素处理后有明显改善,同时Hoechst染色显示,褪黑素处理可以显著减轻高糖诱导的心肌细胞凋亡。在高糖刺激下,心肌细胞中JNK/ERK/p38蛋白的磷酸化水平显著升高,给予褪黑素处理后显著降低。此外,褪黑素处理还显著改善高浓度葡萄糖引起的GRP-78,PERK,IRE1α,ATF-6α,ATF4,CHOP蛋白表达的升高。当转染lncRNA H19 shRNA后,lncRNA H19的表达明显受到抑制,同时加入褪黑素处理会进一步抑制其表达,而miRNA-29c的表达受到进一步上调,MAPK13蛋白的表达进一步降低。用miRNA-29c inhibitor处理后,miRNA-29c的表达受到抑制,与褪黑素同时处理后表达回升,同时褪黑素处理还可以改善miRNA-29c inhibitor引起的MAPK13蛋白表达增多,在转录水平无明显影响。双荧光素酶报告表明miRNA-29c mimic诱导野生型lncRNA H19的荧光素酶活性降低,然而当lncRNA H19的某个位点发生突变时,这种影响就消失了,使用褪黑素处理得到了类似的结果,同时RNA免疫沉淀实验显示lncRNA H19和miRNA-29c的表达明显聚集在免疫沉淀物中说明lncRNA H19直接结合miRNA-29c。另外,miRNA-29c mimic还诱导野生型MAPK13的荧光素酶活性降低,当MAPK13的某个位点发生突变时,这种影响就消失了,使用褪黑素处理也得到了类似的结果。高糖处理会导致心肌细胞中caspase-3活性和DNA片段显著增加。随着lncRNA H19 shRNA的转染,高糖条件下心肌细胞中caspase-3的活性和DNA片段显著减少。使用褪黑素和miRNA-29c mimic处理同样可以减少高浓度葡萄糖引起的心肌细胞caspase-3活性和DNA片段增加。单独转染miRNA-29c inhibitor的高糖组中检测到caspase-3活性和DNA片段的明显进一步增加,当同时使用褪黑素和miRNA-29c inhibitor、lncRNA H19shRNA和miRNA-29c inhibitor处理会显著抑制高糖组caspase-3活性和DNA片段增多。结论褪黑素可以缓解高糖引起的心肌细胞凋亡,其机制与褪黑素对lncRNA H19/miR-29c的表达及对MAPK信号通路和内质网应激的影响有关。