【摘 要】
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microRNA（miRNA）是一种非编码小RNA分子。在病毒感染中,miRNA能通过调节基因转录来调控病毒的增殖。鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu Virus,DTMUV）是黄病毒科黄病毒属单链正股RNA病毒,主要感染禽类。miRNA在其它黄病毒感染中生物学功能已有许多报道,但在DTMUV感染鸭胚成纤维细胞（Duck embryo fibroblast,DEF）中相关报道较少。研究DTMU
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microRNA（miRNA）是一种非编码小RNA分子。在病毒感染中,miRNA能通过调节基因转录来调控病毒的增殖。鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu Virus,DTMUV）是黄病毒科黄病毒属单链正股RNA病毒,主要感染禽类。miRNA在其它黄病毒感染中生物学功能已有许多报道,但在DTMUV感染鸭胚成纤维细胞（Duck embryo fibroblast,DEF）中相关报道较少。研究DTMUV与宿主miRNA的相互作用,对阐释DTMUV感染宿主机制提供重要理论依据。实验室前期预示试验表明,DTMUV感染DEF细胞引起miR-146b-5p大量表达,而关于miR-146b-5p有何功能?尚无相关报道。为此开展相关研究,结果报道如下。1.miR-146b-5p 促进 DTMUV 的增殖DTMUV感染DEF细胞12h、24h、36h、48h后发现:细胞内miR-146b-5p表达出现时间依赖性上升趋势。qRT-PCR和western blot和病毒滴度分析显示:将miR-146b-5p模拟物（mimic）转染到DEF细胞后,细胞上清液中病毒滴度显著升高（P＜0.01）,DTMUV拷贝数显著增多（P＜0.001）,DTMUV E蛋白表达增加。但在转染miR-146b-5p抑制剂（inhibitor）后,均出现显著降低。结果均表明miR-146b-5p可以促进DTMUV增殖。2.miR-146b-5p结合宿主RPS14蛋白RNA pull-down实验沉淀miR-146b-5p结合蛋白复合物并对其进行质谱定性分析。检测到130段多肽以及40个已知蛋白质,其中miR-146b-5p的特异性结合蛋白17个。根据蛋白质匹配分数,检测感染DTMUV后RPS14、Hsp70A8、SRPRB等蛋白mRNA表达变化,结果表明只有RPS14mRNA表达呈现先上升后下降规律性变化,表达水平在36h最高。扩增RPS14核酸序列并以真核表达质粒pCAGGS为载体构建pCAGGS-RPS14 重组质粒。将 pCAGGS-RPS14 质粒转染 DEF 细胞,western blot 验证 miR-146b-5p能与RPS14结合。3.RPS14降低DTMUV的拷贝数和E蛋白表达设计并合成shRNA干扰RPS14表达。检测RPS14对DTMUV复制的影响,结果显示:转染pCAGGS-RPS14重组质粒过表达RPS14后,病毒拷贝数和病毒E蛋白表达量显著减少（P＜0.01）;转染shRNA干扰RPS14表达后,病毒拷贝数和病毒E蛋白表达量显著增多（P＜0.01）。表明:过表达RPS14可以降低DTMUV的复制,敲低RPS14可以促进DTMUV的复制。4.miR-146b-5p通过结合抑制RPS14促进DTMUV增殖检测miR-146b-5p对RPS14 mRNA和蛋白表达的作用,发现过表达miR-146b-5p使RPS14 mRNA水平和蛋白表达量显著降低（P＜0.05）;抑制miR-146b-5p表达使RPS14 mRNA水平和蛋白表达量显著升高（P＜0.05）。这提示miR-146b-5p能抑制RPS14表达。pCAGGS-RPS14重组质粒与miR-146b-5p共同转染入DEF细胞并接毒后,检测病毒拷贝数和病毒E蛋白表达。结果显示共转pCAGGS-RPS14和miR-146b-5p mimic后病毒拷贝数和E蛋白表达显著增多（P＜0.01）。RPS14 shRNA和miR-146b-5p mimic共同转染到DEF细胞并接毒,检测病毒拷贝数和病毒E蛋白表达。结果表明共转4shRNA和miR-146b-5p mimic后病毒拷贝数和蛋白表达无显著差异（P＞0.05）。综上,本试验发现miR-146b-5p可以通过结合抑制RPS14促进DTMUV增殖。
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