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我国属于非传统植胶区,低温和干旱是影响我国橡胶树地理分布和天然橡胶产量的主要因素,因此,培育高产抗低温干旱的优良品种对我国橡胶事业发展意义重大。由于橡胶树是多年生木本植物,常规育种周期长,分子生物学和组织培养技术及基因工程技术的发展为橡胶品种改良创造了条件。WRKY转录因子是近二十年来在植物中发现的一类转录因子,它主要参与调控植物的生长发育,以及各种生物和非生物胁迫的响应。病原菌侵染、创伤、各种非生物胁迫(如干旱、低温、高盐、高渗透压等)和植物信号类物质(如水杨酸、茉莉酸、乙烯、脱落酸等)都能诱导WRKY基因的表达。本研究以低温处理的热研7-33-97为材料,基于本实验构建的橡胶树cDNA文库中WRKY基因的EST片段,通过RACE技术,获得了4个HbWRKY基因,分别命名为HbWRKY1、HbWRKY2、HbWRKY3、HbWRKY4,对其生物学功能进行了研究；并构建植物表达载体,应用农杆菌介导法转化橡胶树愈伤组织。其主要结果如下：1、HbWRKY基因的克隆本研究通过RACE技术,共获得了4个HbWRKY转录因子基因,其中HbWRKY1基因DNA序列全长3780bp,由四个外显子和三个内含子组成,包含一个2211bp的开放阅读框,编码737个氨基酸组成的多肽,含有两个WRKYGQK结构域和两个C2H2锌指结构,属于WRKY基因家族第Ⅰ类。研究发现,HbWRKY1在不同的组织中都存在两种编码框,分别命名为HbWRKY1a和HbWRKY1b。虽然它们编码的肽段长度相同,但结构上有75个氨基酸存在差异。HbWRKY1a理论等电点为6.05,蛋白质的分子量为79.70389KD,HbWRKY1b理论等电点为5.83,蛋白质的分子量为79.6026KD。HbWRKY2基因DNA序列全长2273bp,由六个外显子和五个内含子组成,包含一个1773bp的开放阅读框,所编码的肽段由590个氨基酸组成的多肽,理论等电点为6.36,蛋白质的分子量为63.9419KD,含有一个保守的WRKYGQK结构域和一个C2H2锌指结构,属于WRKY基因家族第Ⅱ类中的第Ⅱb亚类。HbWRKY3基因DNA序列全长1255bp,由三个外显子和两个内含子组成,包含个963bp的开放阅读框。所编码的肽段由320个氨基酸组成,理论等电点为4.80,蛋白质的分子量为36.152KD,含有一个保守的WRKYGQK结构域和一个C2H2锌指结构,属于WRKY基因家族第Ⅱ类中第Ⅱe亚类。HbWRKY4基因DNA序列全长1009bp,由三个外显子和两个内含子组成,包含一个789bp的开放阅读框架,编码262个氨基酸组成的多肽,理论等电点为8.51,蛋白质的分子量为28.8086KD,含有一个保守的WRKYGQK结构域和一个C2H2锌指结构,属于WRKY基因家族第Ⅱ大类中的第Ⅱa亚类。2、HbWRKY基因启动子区域的克隆与分析对克隆得到的4个HbWRKY基因进行启动子克隆并分析,其主要结果如下：其中HbWRKYl基因扩增获得2319bp的启动子序列,该调控区含有W-BOX、响应高温胁迫和茉莉酸甲酯(MeJA)等多种顺式作用元件；HbWRKY2基因扩增获得1276bp的启动子调控区,该调控区含有W-BOX.响应高温(HSE)和水杨酸(TCA-element)等多种顺式元件；HbWRKY3基因扩增获得1068bp的启动子调控区,该调控区含有W-BOX、伤害响应元件(WUN motif)、低温响应元件(LTRE)、脱落酸响应元件(ABRE)等多种顺式作用元件；HbWRKY4基因扩增获得708bp的启动子调控区,该调控区含有W-BOX、脱落酸响应元件(ABRE)、低温响应元件(LTRE)等多种顺式元件。3、HbWRKY基因的功能分析4个HbWRKY转录因子在橡胶树花中的表达量最高。HbWRKY1基因在各种非生物胁迫下表达水平变化不大,但受低温和ABA的诱导。HbWRKY2基因在叶片中响应干旱、PEG、低温胁迫以及受SA的早期诱导表达；在树皮中响应高盐、低温胁迫以及受ET的诱导表达。HbWRKY3基因在叶片中响应PEG、高盐、低温胁迫,以及受MeJA、SA、ABA、H2O2和ET的诱导表达,在树皮中响应干旱、PEG、低温胁迫以及受MeJA、SA(?)口ET的诱导表达；HbWRKY4基因在叶片中响应干旱、PEG、低温胁迫以及受MeJA、SA、ABA、H2O2(?)口ET的早期应答反应,在树皮中响应NaCl、低温胁迫以及受ET诱导表达,且低温胁迫强烈诱导其表达。HbWRKY2超表达增强了拟南芥植株的耐旱性；在高盐胁迫下,HbWRKY2超表达拟南芥植株提高了拟南芥下游基因AtRD22和AtRD29A的表达水平,增强了植株的耐盐能力；在SA的诱导下,HbWRKY2超表达强烈提高了AtNPR1和AtPR1的表达水平,在MeJA诱导下,HbWRKY2超表达强烈诱导了AtLOX2基因的表达以响应MeJA信号途径,说明HbWRKY2可能参与SA和JA信号途径,与植物病原菌的防卫有关；在乙烯诱导下,HbWRKY2超表达抑制了拟南芥乙烯相关基因AtETR1和AtERSl的表达；在低温胁迫下,HbWRKY2超表达拟南芥植株的脯氨酸和可溶性糖含量高于野生型植株,同时提高了下游基因AtRD29A、 AtCOR15A和AtCOR47的表达水平。HbWRKY3超表达增强了植株的耐旱能力；在乙烯诱导下,HbWRKY3超表达拟南芥植株AtERS1和AtETR1基因的表达水平急剧增高。HbWRKY4超表达增强了拟南芥植株的耐旱性；在高盐胁迫下,HbWRKY4超表达拟南芥植株提高了拟南芥下游基因AtRD22和AtRD29A的表达水平,增强了植株的耐盐能力：在乙烯诱导下,HbWRKY4超表达抑制了拟南芥乙烯相关基因AtETR1和AtERS1的表达；低温胁迫下,HbWRKY4超表达拟南芥植株提高了AtCOR15A和AtCOR47基因的表达水平。4、橡胶树遗传转化以EHA105为工程菌株,pCAMBIA2301为植物表达载体,将橡胶树HbWRKY2通过农杆菌介导转化橡胶树热研7-33-97和热研8-79胚性愈伤组织,以uidA基因的稳定表达频率为指标研究共培养时间对遗传转化效率的影响,结果表明热研7-33-97愈伤组织共培养5d的uidA的稳定表达频率最高,热研8-79愈伤组织共培养6d的uidA的稳定表达频率最高。通过Kan筛选,各获得4个热研7-33-97和热研8-79抗性愈伤组织系,经GUS组织化学染色和PCR检测,都为转化愈伤组织系。以GV3101为工程菌株,以bar基因为筛选基因,双丙氨磷为筛选剂,通过根癌农杆菌介导将橡胶树HbWRKY4基因转化橡胶树热研8-79愈伤组织。结果表明双丙氨磷筛选橡胶树愈伤组织的适宜浓度为3mg/L。研究中共获得3个抗性愈伤系,234个抗性体细胞胚和22株再生植株。经PCR鉴定,22株再生植株都为抗性橡胶苗,无一假阳性植株出现。选取13株再生植株进行Southern杂交鉴定,结果表明bar基因以低拷贝整合到抗性再生植株的DNA基因组中。初步建立了以双丙氨磷为筛选剂的橡胶树遗传转化体系。