背景:随着肥胖症在全球范围内的流行,非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）已经成为全球公共健康问题。由于其发病机制的复杂性,目前临床上尚无批准用于治疗NAFLD的特效药。在众多的发病机制中,肝脏脂质合成和分解代谢失衡是引起肝脏脂质大量累积,促进NAFLD发生、发展的核心因素。因此,阐明调控肝脏脂质合成和分解代谢的关键分子机制,是寻找NAFLD治疗靶点的基础。近年研究表明蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰在肝脏脂质代谢的稳态调节方面扮演重要的角色。O-GlcNAc糖基化修饰分别通过O-GlcNAc转移酶（OGT）和O-GlcNAc水解酶（OGA）,在蛋白质的丝氨酸（Ser）和苏氨酸（Thr）残基上添加或水解单个O-连接的N-乙酰葡糖胺（O-GlcNAc）基团,进而影响蛋白质功能。最新研究表明肝脏脂质合成代谢中的多个关键转录因子及相关蛋白受到OGT介导的O-GlcNAc糖基化修饰,如Ch REBP、LXR等脂肪合成相关转录因子被O-GlcNAc糖基化修饰后促进肝脂肪合成;O-GlcNAc修饰的HCF-1蛋白亦可增加Ch REBP转录活性,引起肝脏脂质合成通路活化。尽管大量研究证实异常活化的OGT促进肝脏脂质合成代谢,但是O-GlcNAc糖基化修饰对肝脏脂质分解代谢的作用机制不明;此外,作为O-GlcNAc糖基化修饰的唯一水解酶,OGA在肝脏脂质代谢方面的功能尚未有研究报道。本课题组前期工作观察到NAFLD患者的肝脏O-GlcNAc糖基化修饰水平显著升高,而OGA蛋白的表达水平显著下降,尤其在伴有大量炎细胞浸润的非酒精性脂肪性肝炎（Non-alcoholic steatohepatitis,NASH）的患者中,肝脏OGA的表达水平下降更为明显。基于这些前期结果,我们认为肝细胞OGA在NAFLD的演化中扮演重要角色,其潜在的作用机制仍有待探索。激素敏感性脂肪酶（Hormone-sensitive lipase,HSL）是一种脂肪水解的关键限速酶,其活性主要受磷酸化修饰调控。活化的HSL能够水解三酰甘油（TAGs）、二酰甘油（DAGs）等多种脂质,但不水解磷脂。HSL主要在脂肪组织中表达,少量表达于肝细胞。在小鼠脂肪细胞中,促脂解激素（如皮质激素、肾上腺素、去甲肾上腺素和胰高血糖素）通过c AMP信号级联诱导PKA在HSL的S563位点磷酸化,显著增强HSL脂解活性,而抗脂解激素（如胰岛素）则作用相反。值得注意的是,一项临床研究报道了含有编码HSL的基因发生框移突变的同源基因携带者,表现出脂肪肝、胰岛素抵抗、高脂血症。另外,研究表明小鼠肝脏过表达HSL减轻高脂饮食诱导的脂肪肝。这些研究提示HSL在脂肪组织和肝脏的脂质分解代谢中扮演重要的作用。现有文献表明HSL的蛋白翻译后修饰仅受磷酸化修饰调节,是否存在其它蛋白翻译后修饰尚不清楚。蛋白的磷酸化修饰与O-GlcNAc糖基化修饰紧密相关并相互影响。O-GlcNAc糖基化修饰是否调节HSL,以及HSL在小鼠肝细胞OGA敲除的脂肪肝模型中的作用及分子调控机制仍不清楚。目的:本研究旨在探讨小鼠肝细胞OGA敲除（Hepatocyte OGA knockout,OGA-LKO）在高脂饮食（High fat diet,HFD）诱导的脂肪肝模型中的作用及其分子机制,为临床干预NAFLD进程提供新的理论依据。1.观察肝细胞OGA敲除在小鼠不同饮食条件下对肝脏糖脂代谢、肥胖和能量代谢的影响。2.寻找OGA可能发挥作用的潜在底物蛋白,并明确O-GlcNAc糖基化修饰对新底物蛋白的调控作用。3.鉴定新底物蛋白的O-GlcNAc糖基化修饰位点,揭示O-GlcNAc糖基化修饰对底物蛋白的调控机制及功能影响。方法:1.高脂饮食诱导肥胖和脂肪肝模型的构建利用Cre-Loxp基因敲除系统,率先构建了肝细胞OGA特异性敲除(Alb-Cre OGAflox/flox)的C57BL/6J背景小鼠。在此基础上,通过Alb-Cre OGAflox/flox（OGA-LKO）小鼠与OGAflox/flox（Wild type,WT）小鼠杂交,获取同窝的雄性OGA-LKO和WT小鼠作为后续实验小鼠。待实验小鼠7周龄时给予高脂饮食（HFD,60%fat）16周,构建肥胖和脂肪肝模型。相应的对照饮食组给予普通饮食（Normal control diet,NCD）。期间系统观察肝细胞OGA敲除对脂肪组织、能量代谢、脂肪肝以及糖代谢的影响。2.肥胖相关表型的评估每周固定时间段监测小鼠体重,使用活体小动物体成分分析仪（Echo MRITM-100H,USA）,在小鼠清醒的状态下,精确测量全身体脂（Fat）和瘦体组织（Lean）的含量。当实验达到观测终点后,通过称量肩胛棕色脂肪、3种白色脂肪（腹股沟脂肪、附睾脂肪、肾脏脂肪）的含量,以及后续HE染色,评估肝细胞OGA敲除对饮食诱导肥胖的影响。3.能量代谢的评估利用实验动物代谢笼检测技术（CLAMS,USA）,计算小鼠不同时间段（Light、Dark）以及不同处理（Fed、Fasted）下的氧气消耗量（VO2）、二氧化碳产生量（VCO2）、呼吸熵（RER）,间接评估肝细胞OGA敲除对小鼠全身氧化代谢的影响。通过测量小鼠产热量（Heat）,以及检测肩胛棕色脂肪组织中FGF21和UCP1的蛋白表达情况,评估肝细胞OGA敲除对小鼠棕色脂肪产热的影响。4.脂肪肝和糖代谢的评估测量小鼠肝重、肝-体重指数、血脂（TG、TC、FFA）,结合肝组织HE和油红O染色,判断肝细胞OGA敲除对脂肪肝的影响。通过检测胰岛素抵抗（IPITT、IPGTT、insulin、HOMA-IR）,血内分泌激素（GIP、GLP-1、Glucagon、Ghrelin、Leptin、PAI-1、Resistin）等指标,以及检测3种白色脂肪组织中p-AKT（Ser473）和total-AKT含量,判断肝细胞OGA敲除对小鼠糖代谢的影响。5.多组学联合检测分析利用脂质组学检测技术（Biotree公司,上海）定量小鼠肝脏TAGs、DAGs及CE等13大类脂质含量变化,以此判断肝细胞OGA敲除对何种类型的脂质产生影响。利用转录组学技术（Genergy公司,上海）检测高脂饮食组肝脏差异基因的表达情况。结合能量代谢监测、转录组差异基因生物信息学分析和肝脂质组学,系统分析肝细胞OGA敲除是否对脂质合成或分解代谢通路产生影响,并为后续筛选潜在的O-GlcNAc糖基化修饰底物蛋白奠定坚实的依据。6.O-GlcNAc糖基化修饰底物蛋白的筛选与功能验证在HepG2和SK-hep-1细胞中分别采用OGA抑制剂TMG（100 n M,6h）和shOGA慢病毒提升O-GlcNAc水平,利用pan-O-GlcNAc糖基化抗体进行IP富集潜在结合的O-GlcNAc糖基化底物蛋白,然后进行LC-MS液相质谱检测。对鉴定的底物蛋白进行GO分析和一系列分子生物学实验验证,其结果表明HSL是潜在的O-糖基化蛋白,而且O-GlcNAc糖基化修饰影响HSL蛋白的含量和活性。利用Yin OYang 1.2和OGT site网络数据库分析并预测HSL蛋白潜在的O-GlcNAc修饰位点（Ser565、Ser643、Ser792、Ser961）。通过点突变、IP及脂解等实验,确定HSL的O-GlcNAc修饰位点及其潜在的功能,判断其对脂质分解代谢的影响。7.PPARα激动剂非诺贝特对高脂饮食小鼠肥胖和能量代谢的影响在HFD饮食5周后,将HFD+WT（N=14）和HFD+OGA-LKO（N=18）组小鼠均分为4组,依次命名为HFD+WT+Vehicle、HFD+OGA-LKO+Vehicle、HFD+WT+FN、HFD+OGA-LKO+FN。然后分别予以PPARα激动剂非诺贝特（Fenofibrate,FN,100mg/kg/day,灌胃）或Vehicle（溶媒为2%淀粉溶液）处理。期间观察FN对小鼠体重、体脂和能量代谢的影响。结果:1.肝细胞OGA敲除促进高脂饮食诱导的肥胖表型在NCD饮食条件下,WT组和OGA-LKO组小鼠的体重、体脂（Fat）含量均无显著差异。但是,在给与高脂饮食后,相比于WT+HFD组小鼠,OGA-LKO+HFD组小鼠的体重、体脂含量,以及3种白色脂肪组织（腹股沟脂肪、附睾脂肪、肾周脂肪）的含量均显著升高。而且,上述脂肪组织的HE染色表明OGA-LKO+HFD组小鼠的脂肪细胞直径更大。值得注意的是,虽然该组肩胛棕色脂肪的含量无显著差异,但是HE染色表明棕色脂肪出现明显的白色化现象。这些结果证明小鼠肝细胞OGA敲除促进高脂饮食诱导的肥胖和棕色脂肪白色化。2.肝细胞OGA敲除降低高脂饮食小鼠的氧化代谢和产热在高脂饮食处理前,无论在Fed和Fasted条件下,肝细胞OGA敲除对小鼠的氧气消耗量（VO2）,二氧化碳呼出量（VCO2）和呼吸熵（RER）均无显著影响。但是在高脂饮食4周后,上述指标除RER外均显著降低。尤其是在高脂饮食12周后,不同时间段Fed和Fasted状态下,相比于WT+HFD组,OGA-LKO+HFD组小鼠表现出更低的氧气消耗量和二氧化碳呼出量。这提示肝细胞OGA敲除降低高脂饮食小鼠的氧化代谢。尽管上述两组的呼吸熵（RER）无差异,但其值趋近于0.8,这提示两组小鼠氧化分解代谢的底物均以脂肪和碳水化合物为主。综上,肝细胞OGA敲除降低高脂饮食小鼠以脂肪和碳水化合物为主的氧化分解代谢。另外,OGA-LKO+HFD组小鼠的产热量（Heat）更低,而食物摄取（Food intake）和活动度（Activity）均无显著差异。免疫印迹实验进一步证实HFD+OGA-LKO组小鼠的肩胛棕色脂肪组织中FGF21及其下游靶蛋白UCP1含量均显著下降。这些结果表明肝细胞OGA敲除降低高脂饮食小鼠的棕色脂肪产热。3.肝细胞OGA敲除促进NCD和HFD条件下小鼠脂肪肝的发生和发展在NCD 23周后,WT组和OGA-LKO组小鼠的肝重、肝-体重比,以及血脂（TG、TC、FFA）均无显著差异。然而,肝组织油红O染色提示NCD+OGA-LKO组小鼠的肝细胞聚集大量的脂滴,这提示在NCD一定时间后,肝细胞OGA敲除能使小鼠自发形成脂肪肝。而且,在HFD 16周后,肝细胞OGA敲除导致更加严重的脂质聚集,促进脂肪肝的进展。4.肝细胞OGA敲除加剧高脂饮食小鼠的糖代谢紊乱在HFD 16周时,相比于HFD+WT组,HFD+OGA-LKO组小鼠表现出降低的葡萄糖耐受性（IPGTT）和胰岛素敏感性（IPITT）,以及增加的胰岛素抵抗（HOMA-IR）。而且HFD+OGA-LKO组小鼠的3种白色脂肪组织（腹股沟脂肪、附睾脂肪、肾周脂肪）中p-AKT（Ser473）的蛋白表达均显著下降,这提示OGA-LKO减弱了白色脂肪组织的胰岛素信号通路,促进了外周脂肪组织的胰岛素抵抗。此外,在HFD+OGA-LKO组小鼠中,协同胰岛素抵抗的血清Leptin、PAI-1和Resistin的含量显著增加,而对抗胰岛素抵抗的GLP-1含量显著降低。5.肝细胞OGA敲除促进肝脏脂质大量聚集肝脏脂质组学结果表明,在NCD 23周后,OGA-LKO引起38种TAGs含量显著增加,而在HFD 16周后,OGA-LKO引起266种TAGs、27种甘油二酯（DAGs）和6种胆固醇酯含量显著增加。肝脏转录组学结果显示,在HFD条件下,OGA-LKO引起肝脏1142个基因下调,616个基因上调。差异基因KEGG通路分析表明参与Fatty acid elongation和Biosynthesis of unsaturated fatty acids的信号通路均显著下调,其下调的基因依次为Elovl7、Acot3、Scd1、Acot2、Elovl5、Acot4、Hacd4。这些结果表明肝脏OGA敲除可能抑制了TAGs和DAGs的合成途径。结合减弱的氧化分解代谢（结果2）,这些证据提示肝细胞OGA敲除很可能通过降低肝脏脂质分解的相关代谢通路,进而促进小鼠脂肪肝的发生、发展。6.肝细胞OGA敲除抑制HSL的脂解活性利用panO-GlcNAc糖基化抗体IP富集人肝癌细胞系中潜在的O-糖基化底物蛋白,结合LC-MS检测和生信分析,鉴定出脂肪水解的关键限速酶HSL是潜在的O-GlcNAc糖基化修饰底物蛋白。首先,在NCD和HFD条件下,OGA-LKO导致总HSL蛋白含量显著升高,而代表脂解活性的Ser563 HSL蛋白含量显著减少,这提示OGA-LKO抑制HSL脂解活性。在体外实验中,将小鼠肝原代细胞予以高脂培养基处理后,OGA敲除或活性抑制（TMG）均显著升高总HSL蛋白含量,但减少Ser563HSL蛋白含量和抑制Ser563 HSL由胞浆向脂滴表面的转运,进而促进胞内脂质聚集。此外,在SK-Hep-1细胞中,通过慢病毒过表达OGT、敲低OGA、TMG处理提升细胞内O-GlcNAc修饰水平后均显著增加总HSL蛋白含量,减少Ser563 HSL蛋白含量。这些结果证实肝细胞OGA敲除导致升高的O-糖基化修饰抑制了HSL介导的脂解活性,促进了肝细胞脂质聚集。7.S565位点O-糖基化修饰的HSL抑制其S563位点的磷酸化和HSL的泛素化在小鼠原代肝细胞中,IP实验表明内源性HSL蛋白存在O-GlcNAc基团。另外,在人肝癌细胞系SK-Hep-1中的一系列IP实验证实HSL与OGA、OGT蛋白存在相互作用,而且内源性HSL蛋白也存在O-GlcNAc基团。这些实验充分证明HSL是潜在的O-糖基化修饰底物蛋白。通过2个独立的O-GlcNAc糖基化修饰数据库进行修饰位点预测、修饰位点突变及IP实验,证实S565位点是HSL潜在的修饰位点。在SK-Hep-1细胞中,HSL蛋白在S565位点的O-糖基化修饰抑制其在Ser563位点的磷酸化,从而导致HSL脂解活性减弱。此外,HSL在S565位点的O-糖基化修饰通过抑制蛋白酶体介导的泛素化降解途径,促进HSL蛋白质的稳定性,导致HSL蛋白含量增加。8.PPARα激动剂非诺贝特（Fenofibrate,FN）减轻HFD+OGA-LKO组小鼠的肥胖和能量代谢异常HSL脂解活性的减弱导致肝脏脂解形成的游离脂肪酸（Free fatty acid,FFA）减少,而FFA是激活肝细胞PPARɑ的重要配体。在NCD和HFD条件下,OGA-LKO显著减少HSL的活性,降低了肝脏PPARα蛋白表达。肝源性激素FGF21的生成主要受PPARα调节。OGA-LKO也明显降低了FGF21在肝脏的蛋白表达。而且,HFD+OGA-LKO组小鼠的3种白色脂肪和肩胛棕色脂肪中FGF21的蛋白表达均显著下降。这些结果提示肝细胞OGA敲除通过抑制HSL脂解活性,减弱PPARα-FGF21信号通路,从而加剧高脂饮食小鼠的脂肪肝和肥胖。在HFD 5周后的WT和OGA-LKO小鼠每天灌胃PPARα激动剂Fenofibrate或Vehicle一段时间后,相比于HFD+OGA-LKO+Vehicle组,Fenofibrate显著减轻了HFD+OGA-LKO组小鼠的体重和体脂,增强了氧化分解代谢和产热。这些结果表明肝细胞OGA敲除导致的高脂饮食小鼠肥胖和能量代谢异常的机制很可能依赖于PPARα介导的信号通路,而且肝源性激素FGF21可能是联系脂肪肝和肥胖的关键因素。结论:本研究率先阐明了肝细胞OGA在肝脏脂质分解代谢、糖代谢、能量代谢,以及肥胖中扮演重要的作用,进一步完善了O-GlcNAc糖基化修饰调控肝脏脂质代谢的理论体系。其次,本研究首次证明HSL除受激素和磷酸化修饰调控外,也受蛋白O-GlcNAc糖基化修饰调控。S565位点O-糖基化修的HSL影响其脂解活性和蛋白稳定性。最后,我们的发现扩展了HSL在蛋白翻译后修饰方面的认识,为HSL成为脂肪肝的潜在治疗靶点提供了相应的理论基础。