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百脉根(Lotus corniculatus L.,简写Lotus corniculatus)是豆科(Leguminosae)百脉根属(Lotus)多年生草本植物,广泛分布于欧洲、亚洲、北美洲和大洋洲等地。由于茎叶柔软,细嫩多汁,适口性好,产草量高,耐牧性好,所以百脉根已成为目前世界上最优良的牧草之一。次生代谢产物黄酮类化合物和类胡萝卜素是影响百脉根牧草质量的两大类关键物质。有研究表明,植物界中保守的miR156家族既可以调控植物器官中黄酮类物质和类胡萝卜素的含量,又具有影响地上茎分支多少、增加植株生物量、延迟开花等作用。目前虽然在不同植物中对miR156的功能展开了大量研究,但对其自身的调控机制还不是十分清楚。本工作首先从模式物种光叶百脉根(Lotus corniculatus L. var. japonicus Regel,简写Lotus japonicus)中克隆了百脉根miR156前体基因,并通过在光叶百脉根中过表达该基因验证了miR156的真实性及其功能。进一步通过生物信息学方法鉴定了多条miR156靶标基因,初步阐明了百脉根属植物中可能存在的miR156调控网络。同时,借助第二代高通量测序技术对百脉根的转录组和基因表达谱进行了分析,发现了多个与黄酮类物质合成途径相关的关键酶和转录因子基因。本研究为阐明miR156及其靶基因构成的调控网络提供了新的证据,也为利用miR156对靶标基因表达的调节作用提升百脉根中黄酮类物质和类胡萝卜素的含量及牧草产量打下了基础。具体研究结果如下；1.根据拟南芥Pre-AtmiR156前体序列从光叶百脉根基因组中克隆了一条Pri-LjmiR156a前体序列。通过农杆菌介导的遗传转化方法,获得了两个独立的miR156过表达株系。表型和生化分析结果显示,转基因植株的生物量明显增加,开花受到抑制,类黄酮代谢产物的分布也发生了改变。由于转基因植株的开花时间明显推迟,导致不能产生足够数量的种子。另外,个体与根瘤菌的共生作用也受到影响。相较于野生型植株,过表达植株只能生成50%左右的根瘤。2.利用生物信息学方法在光叶百脉根基因组中确定了多个miR156靶标基因,其中包括多条SPL家族基因。这些SPL基因的活性在miR156过表达植株中受到了选择性的抑制。通过改进的5’-RACE (Rapid amplification of cDNA ends)方法,证实LjmiR156能够识别TC70253、AU089181和TC57859等三个预测的靶标基因,并导致其信使RNA在百脉根中被剪切。通过检测植物与根瘤菌共生作用中关键基因的表达水平,发现在根瘤菌接种初期ENOD40-1、ENOD40-2、POLLUX和CYCLOPS等多个蛋白质编码基因受到miR156的抑制。3.为了在牧草中进一步研究miR156的调控作用,本工作借助高通量测序技术获得了大量的百脉根遗传信息。通过对百脉根进行转录组测序,得到了45,698条unigene,发现了150条与黄酮类化合物积累有关的unigene,覆盖了整个已知的黄酮类化合物生物合成途径。对豆科植物转录因子数据库进行搜索比对,发现2,998条百脉根unigene含有转录因子特征区域。其中unigene322、C12952.Contigl-2、Unigene19239和Unigene2664分别为拟南芥黄酮类合成调控转录因子编码基因TTG1、PAP1, PAP2和TT2的同源基因,它们之间具有很高的相似性。4.通过数字基因表达谱分析百脉根黄酮类合成相关基因在花、果荚、叶和根等不同器官中的表达模式,发现关键酶编码基因和相关的转录因子基因在所测定的四种器官中表达水平不尽相同。WD40家族同源基因unigene322在四种器官中都能够表达；ANR家族的unigene更倾向于在花、果荚及根中表达,在叶片中表达量很低；ANS家族基因更倾向于在花、根和叶中表达。