目的:在20世纪80年代,科学研究者们发现了一种严重威胁人类健康的传染病,获得性免疫缺陷综合征（Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS）,即人们所熟知的艾滋病;艾滋病是由人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV）导致的,会引起免疫系统功能严重缺陷的恶性传染病。HIV主要感染人的CD4+T细胞、巨噬细胞、树突状细胞等,患者主要临床表现为CD4+T细胞逐渐减少,最后导致并发严重的感染而死亡。髓系细胞包括树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞等。这些细胞对病原体有吞噬和炎症反应,并在维持组织平衡、修复损伤和生长发育中发挥保护作用。巨噬细胞广泛分布于所有组织和器官,包括中枢神经系统等,它们参与宿主抗病毒先天免疫反应,同时也是艾滋病病毒感染的重要靶细胞和储存库。组织中定植的髓系细胞是性传播途径中最先被感染的细胞,且在感染的早期抑制病毒的复制,所以研究髓系细胞在HIV感染中的作用,对艾滋病的治疗存在重要意义。多项临床研究发现干扰素与艾滋病的疾病进展密切相关,所以干扰素与HIV-1感染之间的关系在过去十年中受到越来越多的关注。人类急性HIV-1感染会导致体内干扰素-a（Interferonα,IFN-α）的快速增加,是直接抗病毒免疫的核心,并将先天性和适应性免疫反应联系起来。同时,体外研究发现在细胞培养模型中IFN-α对HIV-1的复制产生了明显的抑制作用。由干扰素诱导上调表达的干扰素刺激基因（Interferon-stimulatedgenes,ISGs）如 MX2、APOBEC3G、Tetherin、SAMHD1 等是抑制病毒复制的宿主限制因子,这些蛋白质由ISGs编码,在病毒复制的各个环节发挥抗病毒功能。目前已发现抗HIV-1复制的ISGs的研究主要集中在CD4+T细胞中,ISGs在髓系细胞中抗HIV-1复制的研究相对较少。因此,探究髓系细胞中干扰素抑制HIV-1复制的机制将为治疗艾滋病提供新思路。本研究通过比较HIV感染者与未感染的正常健康志愿者的外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）细胞的差异表达基因（Differentially Expressed Genes,DEGs）筛选得到耳铁蛋白（Otoferlin,OTOF）。OTOF 属于 Ferlins蛋白家族,Ferlins蛋白家族是一种相对较新的大型、多结构域的Ⅱ型跨膜蛋白,涉及以膜融合为中心的多种生物功能。OTOF又名Fer-1类似蛋白2（Fer-l-like protein 2）,Fer-1作为Ferlin家族的成员,首先在秀丽隐线虫中被发现,Fer-1在精子发生过程中是Ca2+介导的膜细胞器与精子的质膜融合所必需的。随后的研究中发现了一个在果蝇中的同源基因misfre,该基因与卵子模式、精子激活和生殖细胞的质膜破裂有关。OTOF是与Fer-1相关的哺乳动物基因家族的第二个成员,故命名Fer-1类似蛋白2。OTOF编码一个预测的胞膜蛋白亚型（1230aa）具有三个C2结构域和一个羧基端跨膜结构域,OTOF编码蛋白的序列同源性和预测结构表明其参与了囊泡膜融合,OTOF蛋白包裹Ca2+,具有Ca2+依赖性,并且在许多方面类似于Ca2+依赖的胞吐。小鼠的耳蜗细胞免疫荧光染色提示OTOF主要表达在耳蜗感受毛细胞。在小鼠处于发育阶段的耳蜗中,定位在毛细胞和传入性神经突触的形成部位;在成熟的小鼠耳蜗细胞中,OTOF的定位局限在内毛细胞中。通过免疫电镜的定位结果也提示OTOF定位于内毛细胞的突触前膜与突触小泡。目前对于OTOF的研究主要集中在人类听力障碍方面,在其他领域尚无报道。本研究发现OTOF主要在髓系细胞中被干扰素诱导上调,并探讨了 OTOF对HIV-1复制的影响并探索其机制,为HIV-1感染的治疗提供了新的线索。研究方法:1.研究对象及分组标准本研究共收集62例样本,样本来源于健康对照者16例（Health组）、接受cART治疗的HIV-1感染者20例（ART+组）和未接受cART治疗的HIV-1感染者26例（ART-组）,其中ART-组中包括长期未进展患者（Long-Term Nonprogressors,LTNPs组）14例,快速进展期患者（Rapid Progressors,RPs组）12例。Healthy组入选标准:身体健康无肿瘤疾病、妊娠、代谢性疾病以及自身免疫病等严重疾病,在最近1个月的时间内没有细菌和病毒感染;ART+组入选标准:已接受cART治疗,且血液中病毒载量小于50 copies/mL;LTNPs组入选标准:患者感染HIV-1达到8年以上,外周血中CD4+T细胞计数每微升大于500个细胞;RPs组入选标准:患者感染HIV-1病毒后1到2年时间内,外周血中CD4+T细胞计数少于每微升350个细胞。本研究已通过中国医科大学附属第一医院伦理委员会的准许。所有参加本实验研究课题的志愿者均被告知相关实验信息,均知情允许,并且签订知情同意书,2.患者血浆病毒载量检测首先采集招募患者的抗凝外周血,将患者的全血离心,取上层新鲜血浆,吸取1.2毫升,用以病毒载量检测。使用罗氏COBASAMPLICOR自动载量分析仪,对患者血浆病毒载量进行检测,检测原理为实时荧光定量聚合酶链式反应RT-qPCR。3.原代PBMCs细胞的分离培养采集招募患者和健康志愿者的抗凝外周血50毫升,轻轻颠倒混匀7次。使用Ficoll法分离PBMCs,将15毫升全血与15毫升PBS混匀,加入到15毫升Ficoll中,使用密度梯度离心法,最上层与中间层之间的云雾层即为PBMCs。依据试剂盒说明书首先用 EasySepTM Human CD14Positive Selection KitⅡ 阳选 CD14+单核细胞,随后根据试剂盒说明书采用EasySepTM Human CD4+T Cell Enrichment Kit负选CD4+T淋巴细胞。4.细胞培养THP-1诱导的巨噬细胞（THP-1-MA）将未处理诱导的THP-1细胞使用含100nM的佛波酯PMA的RPMI1640培养基培养48小时后,即可诱导为巨噬细胞。培养条件:37℃,含5%CO2的培养箱中培养,每2天一次传代培养。人宫颈癌细胞株（HeLa）和人胚胎肾细胞株（293T）采用含有10%FBS和100U/mL青链霉素的DMEM培养基培养,培养条件:37℃,含5%CO2的培养箱中培养,每2天一次传代培养。人白血病T淋巴细胞株（Jurkat）和人白血病单核细胞株（THP-1）采用含有10%FBS和100U/mL青链霉素的RPMI1640培养基培养,培养条件:37℃,含5%CO2的培养箱中培养,每2天一次传代培养。5.RNA测序（RNA-seq）采用TRIzol试剂提取细胞的总RNA,使用微量紫外光可见光分光光度计对RNA样品进行初步定量。对提取的RNA样品浓度使用安捷伦2100精确定量。当RNA浓度、总量、纯度、RIN值符合标准后进行文库构建。首先将样品中的rRNA去除,然后打断成短片段。使用六碱基随机引物并以RNA作为模板,合成cDNA的第一链。加入缓冲液、dNTPs和酶合成cDNA的第二链,纯化成双链cDNA。将纯化的cDNA连接测序接头,并降解含U碱基的cDNA的第二链。通过PCR富集纯化产物,最终得到特异文库。使用定量PCR对文库进行精准定量,当文库的有效浓度大于2nM时,即可上机测序。将各文库依照有效浓度以及目标下机量的需求进行pooling,开始进行SE50测序。6.RT-qPCR使用PrimeScriptTM RT reagent Kit试剂盒去除RNA样品中残留的DNA污染并将 RNA 逆转录成 cDNA。以 cDNA 为模板,采用 TB Green? Premix Ex TaqTM Ⅱ（TAKARA）试剂进行RT-qPCR试验;GAPDH作为内参,应用2-ΔΔCt法,计算目的基因的相对表达量。7.细胞转染293T 和 HeLa 细胞采用 LipoD293TM 转染试剂（SignaGen Laboratories）转染过表达质粒,将质粒溶解在无血清的DMEM培养基中,LipoD293试剂溶解在另一管无血清DMEM培养基,吹打混匀后将稀释的LipoD293加入到稀释的质粒中,涡旋混匀静置孵育10分钟,最后滴加到细胞中,24小时后即可用于后续研究。8.HIV-1NL4-3-Lu。（VSVG）报告病毒包装在293T细胞中进行病毒包装,将10毫升5×106个细胞接种在培养皿中,将6.66μg pNL4-3-Luc 和 3.34μg pCMV-VSV-G 质粒用 LipoD293TM 转染试剂共转到293T细胞中,转染6小时后更换新鲜培养基10毫升,48小时后收集上清液,使用0.45 μm滤器过滤细胞碎片。使用HIV-1 p24 Antigen Capture Assay试剂通过ELISA法对病毒进行定量,-80℃保存用于后续使用。9.shRNA慢病毒包装采用LipoD293TM转染试剂向5 ×106个细胞中转染5μg shRNA慢病毒表达质粒,3.75μg psPAX2包装质粒和1.25μg pMD2.G质粒,转染6小时后更换新鲜培养基10毫升,48小时后收集上清液,使用0.45 μm滤器过滤细胞碎片。使用HIV-1 p24 Antigen Capture Assay试剂通过ELISA法对病毒进行定量,-80℃保存用于后续使用。10.荧光素酶活性检测用300微升1x Passive Lysis Buffer裂解细胞,放在摇床上进行裂解,150转10分钟。吸取50微升上清,避免吸入细胞碎片,加入25微升荧光素酶底物,通过酶标仪进行荧光素酶活性检测。11.流式细胞术分析将目的细胞培养和相应处理后,将细胞悬液转移到流式管中,用1毫升含有2%血清PBS的FACS Buffer洗两次,最后用100微升FACS Buffer重悬,加入相应浓度荧光标记抗体孵育30分钟。用FACS Buffer洗两次,最后用300微升FACS Buffer重悬,即可上机检测。流式细胞仪上选择相应的激光及检测通道对细胞进行分析,具体操作参考索尼ID7000说明书。12.免疫印迹分析收集细胞样品,加入300微升RIPALysis and Extraction Buffer试剂重悬裂解细胞样品,将样品置于冰上10分钟预冷。用超声破碎仪对残留的未裂解成分进行破碎。离心后吸取上清至一干净新管中,加入相应体积的4×Protein SDS PAGE Loading Buffer,煮沸使蛋白变性。用SDS-PAGE凝胶配制试剂盒配制适合目标蛋白大小浓度的凝胶,使用80V电泳通过浓缩胶,使用120V进行电泳通过分离胶。甲醇激活PVDF膜,在冰上恒压60V转膜2小时。采用2%的BSA室温封闭1小时,一抗过夜4℃孵育,PBST洗3次,每次10分钟,洗去未结合的一抗;二抗在室温孵育30分钟,使用PBST洗膜3次,每次10分钟,洗去未结合的二抗。将洗净的膜置于ECL发光液中,孵育1分钟,在凝胶成像分析仪上进行显影成像,GAPDH蛋白作为内参进行结果分析。13.HIV膜融合检测在293T细胞中包装病毒,使用LipoD293TM转染试剂进行转染,将6μg pNL4-3 proviral DNA,2μg of pCMV-BlaM-Vpr,和 10μg pAdVAntage 载体转染到 5×106 个293T细胞中,6h更换新鲜培养基,2d后收集上清液,使用0.45μm滤器过滤细胞碎片,72,000×g,90min,4℃超速离心,10倍浓缩病毒,ELISA定量P24浓度;将400ng病毒感染0.5×106个TZM-bl细胞4h,洗去病毒;使用CCF2染料室温避光染色1h,洗去染料后使用development media室温避光孵育16h;使用含1.2%的多聚甲醛的FACS Buffer,4℃固定24h后使用流式细胞仪检测,被裂解的CCF2使用Pacific Blue进行检测,未裂解的CCF2染料使用BV510进行检测。14.统计学分析采用SPSS26.0对数据进行统计分析。计量资料以x±S表示,相关性分析采用Pearson相关性检验,多组间比较采用one-way ANOVA分析,两组间比较采用students’t检验,组间两两比较采用SNK检验。当P＜0.05认为差异有统计学意义。统计数据通过GraphPad 9.0对数据进行作图。流式分析通过FlowJo 10.4软件进行分析及作图。结果:1.OTOF的鉴定及其抑制HIV-1复制的研究1)对5名HIV感染者及5名健康志愿者的PBMCs细胞的转录组进行测序分析,以 padj＜0.05＆log2|FoldChange|＞1 作为筛选标准,结合 KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）和 GO（Gene Ontology）富集分析及生物信息学网站进行检索,并对初选的差异表达基因在神经、分泌、免疫和再生等生理过程中的作用进行分析,结合基础筛选试验结果,我们最终筛选出OTOF为兴趣蛋白。2)通过RT-PCR对RNA-seq的筛选结果进行验证,发现未治疗患者血清病毒载量随着其PBMCs中OTOF的表达量增高而降低（P=0.005 R=-0.53）,同时比较健康人、接受cART治疗患者和未接受cART治疗患者PBMCs的OTOF mRNA表达发现,未接受cART的患者PBMCs的OTOF表达较高,而健康人和接受cART的患者PBMCs的OTOF表达水平则相对较低（P＜0.01）。3)检测多种细胞系及原代细胞中OTOF mRNA的表达水平,发现经IFN-α刺激后的 MDMs、MDDCs 和 THP-1-MA 细胞中 OTOF 高表达,而 293T、HeLa、Jurkat、激活CD4+T细胞和未经干扰素刺激的MDMs、MDDCs、THP-1-MA中OTOF表达较低,所以后续实验将在OTOF低表达细胞中进行过表达实验,在OTOF高表达细胞中进行敲减实验。4)通过在生物信息学网站中检索发现OTOF存在多个亚型（isoforms）,在293T细胞中分别过表达其中isoforms201、203、204、205亚型,并感染HIV-1报告病毒HIV-1NL4-3-Luc（VSVG）,结果显示:仅 OTOF-204 能够抑制 HIV-1 复制（P＜0.01）,发现OTOF-204有较强的抗病毒功能,其他亚型没有明显的抗HIV-1病毒复制的功能。Infectivity试验的结果表明OTOF对HIV-1复制的晚期步骤没有明显影响。在293T细胞中过表达 OTOF-204,分别感染 HIV-2Rod-Luc（VSVG）、MLV-Luc（VSVG）报告病毒,结果显示OTOF能够抑制HIV-2复制（P＜0.01）,对MLV没有明显的抑制作用（P＞0.05）。5)使用OTOF-204或对照慢病毒表达载体包装的病毒感染原代MDM和激活的CD4+T细胞,筛选成功过表达的细胞,分别感染HIV-1AD8和HIV-1NL4-3病毒,连续收集培养液上清并检测p24,结果显示两组病毒复制随着时间延长差别越来越大,与Lenti-Ctrl组进行对比,OTOF能够抑制HIV-1病毒的复制。2.OTOF对干扰素抗HIV-1病毒功能影响的研究1)在MDMs、MDDCs、THP-1-MA、CD4+T细胞中使用不同干扰素亚型刺激,通过荧光定量PCR检测OTOF表达量,结果表明在MDMs、MDDCs、THP-1-MA中,IFN-α、IFN-β可以诱导OTOF表达升高,而IFN-γ不能诱导OTOF的表达增高,而在CD4+T细胞中各种亚型的干扰素仅轻度的上调OTOF表达。2)用 IFN-α 刺激 MDMs、MDDCs、THP-1-MA、CD4+T 细胞 24/48/72 小时后检测OTOF的表达量,结果发现在MDMs、MDDCs、THP-1-MA细胞中OTOF的表达量随着IFN-α刺激时间延长而增加。3)在THP-1-MA细胞系中使用shRNA敲减OTOF,细胞使用IFN-α处理或不处理,与sh-nontarget对照组相比,敲减OTOF的组中,IFN-α抑制HIV-1复制的能力下降（p＜0.01）;在MDM细胞中使用siRNA敲减OTOF,使用IFN-α处理或不处理,与si-Ctrl对照组相比,敲减OTOF的组中,IFN-α抑制HIV-1复制的能力下降（P＜0.01）;使用shRNA包装的慢病毒感染MDM敲减OTOF,嘌呤霉素筛选,细胞使用IFN-α处理或不处理,与sh-nontarget对照组相比,敲减OTOF的组中,IFN-α抑制HIV-1复制的能力下降（P＜0.01）;结果表明OTOF是干扰素在髓系细胞中发挥抗HIV-1病毒功能的重要因子。3.OTOF抗HIV-1复制的机制研究1)在293T细胞中转染OTOF-GFP质粒,同时对膜蛋白Caveolin进行免疫荧光染色,结果发现OTOF与Caveolin定位基本重合,表明OTOF定位于细胞膜,是一种膜蛋白2)通过 HIV-1 Attachment Assay 试验和 HIV-1 Fusion Assay 试验,结果显示OTOF并不影响HIV-1与靶细胞的接触粘附,而是通过抑制HIV-1病毒膜融合的方式抑制HIV-1复制。3)因为OTOF是一种钙离子传感器,所以我们对钙离子对OTOF抑制HIV-1复制功能的影响进行研究,在293T细胞中过表达OTOF-204,随后使用不同浓度的Ca2+处理细胞,同时用Mg2+处理作为对照,结果显示单独应用钙离子对OTOF抑制HIV-1复制没有明显的作用（P＞0.05）。4)为了寻找OTOF抑制HIV-1复制的作用位点,我们构建了 OTOF-204的缺失突变质粒,随后在293T细胞中过表达这些缺失质粒,并感染HIV-1NL4-3-Luc（VSVG）报告病毒检测荧光素酶Luciferase活性,与全长OTOF-204做对比,结果显示过表达540-640aa、810-910aa和1170-1230aa缺失的质粒抗HIV-1复制的能力下降,这几个缺失位点为我们寻找的OTOF-204抗HIV-1的作用位点。结论:1.OTOF在HIV-1感染患者体内高表达。2.OTOF在髓系细胞中可被干扰素诱导表达上调。3.OTOF能够抑制HIV-1、HIV-2复制,对MLV没有明显的抑制作用。4.OTOF是干扰素在髓系细胞中发挥抗病毒功能的重要因子。5.OTOF通过抑制HIV-1膜融合,从而抑制HIV-1的复制;单独应用钙离子不影响OTOF的抗病毒功能。