随着细菌耐药性的出现与发展,使得人们必须不断开发新的抗生素,并且寻找新的抗菌靶点。萜类化合物是自然界分布最广泛的一大类物质,它们在微生物、动物、植物等众多生命体的生长发育过程中起着极其重要的作用。研究发现,绝大多数细菌及疟原虫等通过2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸（MEP）途径合成它们体内所必需的萜类物质,而高等动物则是以甲羟戊酸（MVA）途径合成。这一现象提示研究者们,MEP途径可作为筛选抗菌化合物的靶标,因此对MEP途径关键酶作用机制的研究及其抑制剂的筛选已成为近年的研究热点。1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构化酶（DXR,或称MEP合酶）在二价金属离子和NADPH的辅助下催化底物1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸（DXP）发生重排-还原反应形成MEP。对DXR催化机理的深入研究,导致了一系列DXR酶抑制剂的发现,其中大部分为底物或反应中间体的结构类似物,如膦胺霉素及其类似物FR900098等,这些抑制剂在体外和体内都显现出了非常强的抗菌/抗疟活性。近期通过全基因组测序与比较基因组学的研究发现,布鲁杆菌属（Brucella）和巴尔通体属（Bartonella）等致病微生物以MEP途径合成萜类化合物生物合成前体物质,但菌株的全基因组序列中并没有发现编码DXR的基因。深入的分析发现,它们体内MEP的合成是由另外一种依赖于NADPH的氧化还原酶所催化的。由于这种新发现的MEP合酶在一级结构及空间结构上与DXR都有很大的差异,因此将其称作II型MEP合酶,又称作DRL（DXR-like）。虽然DRL与DXR都可以催化同一个反应,但由于DRL独特的活性中心区域,使得以DRL为靶点筛选的抑制剂仅能杀灭使用DRL催化的菌株,同时又不影响含有DXR的有益菌（如肠道内的有益菌群等）变得可能。这也表明了以DRL为靶点筛选的抑制剂抗菌谱会更窄。而以DRL为靶点筛选抗菌化合物时,首先需要阐明DRL的催化作用机制。动力学同位素效应（KIEs）在推测化学反应机理、研究化学反应动力学以及生物酶催化等方面往往能起到事半功倍的效果。我们课题组已经成功制备了来源于牛流产布鲁杆菌（B.abortus）的DRL蛋白（BaDRL）,并分析了影响酶反应速度的多个因素。在此基础上,本研究通过检测BaDRL酶催化反应的同位素效应来探讨DRL催化底物DXP的重排机制,同时还将采用柱前衍生-HPLC-MS的方法测定BaDRL催化反应产生的可能中间体。首先酶法合成了未标记及C-13标记的底物DXP,包括[1-¹³C]DXP、[3-¹³C]DXP、[4-¹³C]DXP、[3,4-¹³C₂]DXP,然后利用MS手段测定了BaDRL催化反应过程中的一级同位素动力学效应,结果表明以[1-¹³C]DXP为底物时不存在同位素效应,而分别以[3-¹³C]DXP或[4-¹³C]DXP为底物时则观察到了同位素效应,尤其以[3,4-¹³C₂]DXP为底物时同位素效应更加明显。以上结果说明BaDRL在催化底物DXP重排过程中导致了底物3位和4位碳原子杂化状态的改变,而1位C原子在底物重排时则没有变化。结合对DXR酶催化机制的研究可以推测BaDRL催化底物的重排机理为Retro-Aldol/Aldol机制,即底物C3和C4都经历了sp3到sp2的杂化状态变化。DRL催化底物的重排机制与DXR的相同,提示我们BaDRL催化反应过程中形成的中间体与DXR的应该一致。按照此重排机制,DXR或DRL催化反应过程中会形成三个中间体,分别为:烯醇化羟基丙酮、磷酸羟乙醛和2-甲基-D-赤藻糖-4-磷酸（MEsP）。这些中间体的水溶性较强,且都不含有生色基团,很难直接检测,但由于它们的结构中都含有羰基,因此可以经衍生化后再进行检测。本论文建立了以2,4-二硝基苯肼（DNPH）为衍生化试剂检测羟基丙酮和磷酸羟乙醛的方法,同时也初步探索了以O-（2,3,4,5,6-五氟苄基）-羟胺（PFBHA）、对氨基苯甲酸（PABA）以及N-丙基-4-肼基-1,8-萘二甲酰亚胺（NPHNA）为衍生化试剂检测羟基丙酮和磷酸羟乙醛的方法。以上研究结果为DRL催化机理的揭示和酶反应过程中中间体的检测打下了良好的基础,并将为以DRL为靶点筛选抗菌化合物提供新的思路。